潘铜华 GSH含量测定

GSH 含量测定

园艺学院 潘铜华

【原理】GSH+TDBN在 pH7时生成黄色物质，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系。即：在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。GSH+TDBN------- pH7------黄色物质。【意义】了解到谷胱甘肽（GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，并了解了它的一些其他理化性质，掌握GSH 含量的测定方法。 1 材料与方法 1.1 材料

新鲜的小麦叶片。 1.2 方法

1.2.1 制作标准曲线：

取7支刻度试管，编号，按表加入试剂：

试剂（ml） 0.05mg/ml GSH标准溶液

补蒸馏水到2ml 磷酸缓冲液 DTNB试剂 GSH浓度（ug/2ml）

A412

将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min。在412nm波长下测定吸光度。以标准溶液中GSH浓度为X，吸光度为y，制作标准回归方程，（并求出GSH含量。）

1.2.2样品测定：

1.2.2.1称取植物鲜样0.2g加入少量5%偏磷酸研磨提取，并用5%偏磷酸定容到10ml。 10000rpm离心10min。

1.2.2.2取离心后取上清液2 ml，同标准曲线操作。

试管号

1 0 2 4 0.4 0

2 0.1 1.9 4 0.4 5

3 0.2 1.8 4 0.4 10

4 0.4 1.6 4 0.4 20

5 0.6 1.4 4 0.4 30

6 0.8 1.2 4 0.4 40

7 1.0 1.0 4 0.4 50

1.2.3 结果计算：

GSH含量（μg/gFW）=(C ×Vt )/ (Vs*gFW )

其中：C ：2ml 样样品中GSH的含量（ug） Vt：样品总体积 结果：得出标准曲线为：y=0.013x-0.014 R2=0.998 由于：小麦叶片质量FW=0.2g. 吸光度A=0.052

得：样样品中GSH的浓度C=（0.052+0.014）/0.013=5.0769 ug 所以：GSH含量（μg/gFW）=5.0769×10/2×0.2=126.925μg/gFW

讨论：1、实验过程中由于试验台上的偏磷酸被误认为是磷酸缓冲液，因而做标曲时溶液一直都是无色，没有黄色出现。后面仔细检查试剂后发现了原因。去别的试验台取过来一些缓冲液，重新做标曲，得出正确结果。得出结论：做实验前一定要提前准备好试剂，整齐排放在试验台跟前，以备使用。同时避免混用、错用试剂。

2、叶片的研磨要充分，而且最好是快，在暗处最好，以免仪器立体叶片中化学物质的消耗分解而是实验失败。

3、用滴定管添加试剂时，视线应与凹液面在同一水平面上，用合适量程的滴定管，添加大剂量时用大滴定管，小剂量时用小滴定管。以免多加或少加试剂。

4.比色时比色皿光面要用专用的纸张擦洗干净，以免由此引来的实验误差。 实验注意事项：

1. 做好实验前的预习及准备。每次实验前务必将指定项目的实验指导仔细阅读，熟悉每项实验的目的、原理、方法和操作程序，并复习教材或笔记中有关部分，使实验进行时能独立操作及分析实验结果。

2、一定要根据实验要求一步步的进行，不可倒序，添加试剂时应该一样试剂全加齐了再加下一种试剂，以免漏加。

3、叶片的研磨要充分，而且最好是快，在暗处最好，以免仪器立体叶片中化学物质的消耗分解而是实验失败。

4、用滴定管添加试剂时，视线应与凹液面在同一水平面上，用合适量程的滴定管，添加大剂量时用大滴定管，小剂量时用小滴定管。以免多加或少加试剂。 5.比色时比色皿光面要用专用的纸张擦洗干净，以免由此引来的实验误差。 6、试剂使用时避免溅到脸上或身上，一定要注意安全操作方法。

7、实验结果应根据自己实验所得如实记录，不得擅自修改。如因不严格按实验操作规程进行实验，而导致实验失败时，必须重做。