微生物学
验 指 导 书
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实
目录
实验一 玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术 ................................................................... 3 实验二 培养基的配制 ........................................................................................................... 8 实验三 从土壤中分离微生物及纯化 ................................................................................. 11 实验四 微生物的接种技术 ................................................................................................. 14 试验五 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 ......................................................... 17 实验六 细菌的简单染色和革兰氏染色 ............................................................................. 20 实验七 大肠杆菌生长曲线的测定 ..................................................................................... 23 实验八 实验室环境和人体表面微生物的检查 ................................................................. 25 实验九 乳酸菌的检测 ......................................................................................................... 28
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实验一 玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术
【目的要求】
1. 学习并掌握棉塞制作的目的、原理及方法； 2. 学习并掌握玻璃器皿清洗及包扎方法； 3.掌握高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。 4.了解其它常用消毒灭菌技术原理及技术
【基本原理】
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较大的影响。
微生物学实验所用的器皿，大多数要进行清洗、消毒、灭菌，才能用来培养微生物。玻璃器皿的包扎方法正确合理，在使用过程中才能有效防止杂菌的污染。玻璃器皿包扎好后，一般用高压蒸气灭菌法进行灭菌。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到100℃以上的高温，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。此外，常见灭菌方法还有干热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。对空间灭菌常使用甲醛加高锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌方法。
【实验用品】
棉花，试管，培养皿，纱布，三角瓶，棉线，量筒，牛皮纸（或旧报纸），LDZX-50KBS立式高压蒸气灭菌锅，常用灭菌用具、药剂等等。
【方法步骤】 一、棉塞的制作
正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口（或三角瓶口）完全适合，过紧妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。制作过程见图1，包括取棉花、整理、折角、卷紧、成形、塞试管等步骤。塞上棉塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。
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图1 棉塞制作过程
做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格昂贵。此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞，即用几层纱布（一般8层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体
的生长或发酵，通气塞的形状如图2。
A. 配制时纱布塞法； B. 灭菌时包牛皮纸； C. 培养时纱布翻出
图2通气塞
二、玻璃器皿的清洗
1. 不能用有腐蚀性的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。
2. 用过的器皿应立即洗涤。
3. 强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸内。
4. 含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然后再用洗洁精清洗。凡遇有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。
5. 一般的器皿可以用去污粉、肥皂或洗洁精清洗，油脂很重的器皿应先将油脂擦去。沾有煤膏、焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或有油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、汽油、丙酮等）揩去。
6. 载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡2 小时，用清水冲净，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于95%酒精中保存备用。
7. 洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。
三、玻璃器皿的包装
1. 培养皿的包装
培养皿常用旧报纸紧紧包裹，一包7～10套，包好后干热或湿热灭菌。如果将培养皿放入金属筒内进行干热或湿热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图3），此
A. 内部框架 B. 带盖外筒 图3 培养皿金属灭菌筒
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