解的药品中，加热融化，最后补足所失的水分。
3. 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4. 过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗或分装器以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6. 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非 脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状，大小和松紧度要合适，
四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。有些微生物需要
图10 简易分装器
更好的通气，则可用通气塞。有时也可用硅胶塞、试管帽或塑料塞代替棉塞。
7. 包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5～7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明，培养基名称，组别，日期。
8. 灭菌 将上述培养基于121℃，湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，应放入冰箱内暂存。
9. 倒平板摆斜面 灭菌后，倒平板或制斜面。如制斜面应趁灭菌后未冷却前摆放成斜面，
倒平板可放置到需要时，再加热溶化制作。 10. 无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 二、高氏Ⅰ号培养基的配制
（一）配方：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15~20g，水1000mL，pH7.4~7.6。 （二）步骤：
l. 称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性
图11 倒平板方法
淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，
至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL
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的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2. pH调节，分装，包扎，灭菌及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 三、PDA培养基的配制
（一）配方：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖 20克，琼脂15~20g，水1000mL，pH自然 （二）步骤：称取洗净去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，取滤液，加热，再据实际实验需要加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20-30分钟左右后取出，试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
【实验结果】
记录本实验配制培养基的名称，数量，并说明无菌检查结果，培养基状况及可否使用等。
【注意事项】
1. 称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2. 培养基配制加热过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。 3. 灭菌锅操作安全及摆斜面要求。
【实验思考题】
1. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌，若不能及时灭菌应如何处理。 2. 已灭菌的培养基应如何进行无菌检查。 3. 试设计实验对饮料进行无菌检查。
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实验三 从土壤中分离微生物及纯化
【目的要求】
1. 了解学习分离、纯化技术的概念。
2. 学习掌握涂布、划线等稀释分离微生物技术。
【基本原理】
分离就是把成群的菌体一个一个地分开；纯化就是进一步分离，把菌种绝底分成单个菌体的技术。要想从含有多种多样、多姿多态微生物的自然界中获得我们所需的菌（菌株），就要通过各种手段方法把一个一个微生物分离开，然后从中挑选出我们所需要的菌株应用于研究或生产之中。分离技术有许多种，下面着重介绍从土壤中通过划线法分离细菌、放线菌、霉菌的技术。
【实验用品】
1. 药品及试剂 牛肉膏蛋白胨平板、高氏1号平板（含1%酚液5~6滴/L）、PDA平板（含80%红酸1mL/L），土壤样品，无菌水等。
2. 仪器及其它用品 接种环，酒精灯，超净工作台等。
【方法步骤】
取土壤少许，加入一定量的无菌水，制成系列土壤菌悬液。1、涂布法： 1） 取土样 取
图12 土壤梯度稀释操作过程 图13平板涂布操作图
表层以下5～10 cm 处的土壤，放入取样袋中，置于4℃冰箱中暂存。
2） 土样处理 取土样10 g，迅速倒入带玻璃珠的90 mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为宜），振荡15～25 min，使土样充分打散。
3） 梯度稀释 用1 mL的无菌移液管，从中吸取1 mL的土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的试管中，充分混匀，然后用无菌移液管从此试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2.、10-3、10-4、10-5等不同梯度的土壤溶液（操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将
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移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差）。
4） 涂布 取平板，皿底分别用记号笔写上稀释度，然后用无菌移液管分别从10-6. 10-5.
10-4三管土壤稀释液中各吸取0.1 mL对号放入已写好稀释度的平板中（从低浓度到高浓度依次取，不用更换移液管），用无菌玻璃涂布棒按图13，在培养基表面轻轻涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌液吸附进培养基。
2、划线分离法（在接种室或超净工作台内进行）
（1）直线划线法：左手拿平板平皿，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸一
图14平板划线法操作图
环土壤菌悬液，在平板一边划第一道平行线2~3条，转动培养皿约70度角，用烧灼过的接种环，待冷却后，接种环从第一道线划过做第二道平行线，同法划第三道平行线，如此划第四道平行线（如图14、15）。每种培养基划线一套。
（2）曲线划线法：其它操作如同直线法，只是划线是划成曲线。每种培养基划线一套。
（3）划线完后，把平皿倒置放在30℃下培养，细菌分离要培养24~48h，放线菌分离要培养5~7d；霉菌分离要培养3~5d。观察生长的菌落（图5-3），再作进一步的分离纯化或直接挑取单个菌落接入斜面培养后保存备用。
3、挑取单菌落进一步划线或涂布纯化。
图15 平板划线法操作图
图17 划线分离出的细菌单菌落 【实验结果】
记录本实验结束后有无微生物生长，微生物主要种类及菌落形态特征。
【注意事项】
1、分离纯化操作全过程要在无菌室或超净工作台内进行。
2、划线时时，接种环要圆滑；接种环与平板成45°角，用手腕力轻巧地在平面上滑动，避免划破培养基；防止在空间划线。
【实验思考题】
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