试验五 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察
【目的要求】
1. 了解枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及毛霉(Mucor)、根霉(Rhizophs)?、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、木霉(Trichoderma)等常见微生物形态构造；
2.进一步巩固细菌、霉菌、酵母菌和放线菌的代表种类的菌落特征；
3.了解细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的繁殖方式及特点。
【基本原理】
微生物的菌落特征是指微生物在平板上生长，所表现出的群体形态特征。每一种类微生物菌落具有各自相对稳定的特征，例如菌落的大小，菌落边缘形状、隆起形状、表面形态，菌落透明或不透明等。这些特征可用于快速识别、鉴定微生物，在科研和生产实践中常被采用。细菌为单细胞微生物，大小仅为数毫米；
放线菌丝状，菌丝直径与细菌相接近；酵母菌为真核细胞；
图22 微生物菌落的培养特征
霉菌由菌丝组成，许多菌丝交织在一起形成菌丝体。在固体培养基上长成绒毛或棉絮状。霉菌的繁殖方式多种多样，有无性和有性生殖方式。因此各类微生物较容易区别。
【实验用品】
1. 实验材料 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及毛霉、根霉、曲霉、青霉、木霉等常见微生物菌落平板及永久固定装片；
2.实验试剂 75%酒精，95％酒精，乳酸石碳酸棉兰液，蒸馏水等； 3.实验设备仪器 载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，酒精灯，显微镜等。
【方法步骤】
一、观察并比较常见微生物菌落形态
依次观察各类微生物平板，注意并记录各种微生物菌落形态特征。 二、观察细菌形态结构
1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌体于水滴中，用解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片?(注意不要产生气泡，并不要移动载玻片)。
2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜及油镜观察。注意观察细胞形状，各部分结构，以及是否有芽孢等。
三、观察放线菌菌丝体形态结构
1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌丝于水滴中，用解剖针
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将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片?(注意不要产生气泡，并不要移动载玻片，以免弄乱菌丝)。 2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜观察菌丝及孢子器各部分的特征。 四、观察酵母菌形态结构
1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌量于水滴中，用解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片?。
2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜及油镜观察。注意观察细胞形状，各部分结构，以及是否正在进行出芽生殖等。 五、观察霉菌菌丝体形态结构
1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌丝于水滴中，用解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片?(注意不要产生气泡，并不要移动载玻片，以免弄乱菌丝)。 2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜观察菌丝及孢子器各部分的特征。 附：若需长时间的观察霉菌的形态，可制成永久片，制作方法为：
1.在洁净载玻片上滴一滴乳酸石碳酸棉兰液，然后挑取要观察的菌丝少许于染色液中，用解剖针仔细将其分开，然后盖上盖玻片，放置1～2天。
2.在制取的片中用阿拉伯胶(或合成树脂、加拿大胶)将盖玻片四周封好，待凝固后即可进行观察，也可放置起来作为永久片保存。 五、观察常见微生物永久装片
观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及毛霉、根霉、曲霉、青霉、木霉等永久装片，尤其注意其是否正在进行分裂及无性孢子、有性孢子繁殖结构及特点。 附根霉接合孢子形成的观察：
1.取黑根霉Rh＋和Rh－菌株分别划线接种于马铃薯培养基平板两侧，置30℃恒温箱培养4～7天。
2.?培养4天后，Rh(＋)和Rh(－)菌株互相邻近的两个菌丝各向对方生出极短的侧丝，逐渐互相接触，顶端各自膨大并形成横隔，即为配子囊。 3.配子囊接触后中间的隔膜消失，二者的细胞质和细胞核互相融合，同时外部形成厚壁，成为接合孢子。
4.用水浸片仔细观察接合孢子形成的各个阶段。
【实验结果】
1、填表比较四大微生物形态特征
项目 含水状态
菌落
形态 颜色 透明度 与培养基结合程度 细胞显微形态
气味 其它
细菌
放线菌
酵母菌
霉菌
2、按比例绘出常见微生物结构图（不少于5种），并图示各部分结构。
【注意事项】
1、观察平板菌落时，养成良好习惯，最好不要打开培养皿盖。
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2、制作微生物装片应按实验装片制作规范要求制作，并注意与永久装片进行比较。
【实验思考题】
设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别。
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实验六 细菌的简单染色和革兰氏染色
【目的要求】
1. 学习并掌握细菌的简单染色法； 2. 学习并掌握细菌革兰氏染色法。
【基本原理】
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
【实验用品】
1. 实验材料 培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）（均为活体材料）； 2.实验试剂 结晶紫，卢哥氏碘液，95%酒精，蕃红，复红，二甲苯，香柏油等 3.实验设备仪器 废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等
【方法步骤】
一、简单染色：
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜） （4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加
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