蛋白酶生产和应用的进展 - 胡学智

　第4期

胡学智,等:蛋白酶生产和应用的进展

第38卷　

血红蛋白,对血小板凝聚有强烈抑制作用,具有良好溶栓作用,其溶解血栓的效果是血纤维蛋白酶之4倍,在人体内半衰期比尿激酶、链激酶等溶栓酶长,常食纳豆可预防血栓、中风、心脑梗塞等症就是纳豆激酶之故。纳豆激酶溶解血栓的机制有四:(1)刺激血管内皮细胞产生激活剂将纤维蛋白酶原转化为纤维蛋白酶,(2)激活体内尿激酶原成为尿激酶,后者再作用于血纤维蛋白酶原将其转化为血纤维蛋白酶而作用于血栓,(3)将尿激酶和血纤维蛋白酶原激活剂抑制剂破坏而失活,(4)直接作用于血栓而分解血栓。

　　此外还有一些蛋白酶如胶原酶之用于植皮、清创、脱痂,透明质酸酶,尿激酶,链激酶,曲肽酶之用于治疗血栓,弹性蛋白酶用于治疗动脉硬化,凝血酶用于止血,以及蛋白酶之用于解蛇毒等。

研究,笔者发现固体培养时,添加3%～5%纯碱,蛋白酶活性可增加30%,液体培养时添加洗净剂LS0.1%,可使通风量下降50%以上,酶活性增加60%。于是1967年建温州发酵化工厂生产。3942蛋白酶曾一度广泛使用在全国制革、毛皮、明胶、生化制药等行业。将3942蛋白酶经DEAE-sephadexA25、DEAE-sephrosecl-6层析得电泳匀一纯品,测得分子量64000～67000,由两个亚基构成。轻工业部食品发酵研究所等,从土样筛选出微白色放线菌166,其蛋白酶用于猪羊皮脱毛,具有脱毛较净,毛孔清晰,不损粒面等优点。该酶在上海酒精厂投产,湖北省微生物研究所等筛选出中性蛋白酶生产芽孢杆菌172,经免疫等交叉凝聚反应和琼脂对流免疫电泳试验结果表明该酶与1938蛋白酶间有共同抗原。浙江省轻工研究所、无锡轻工学院等亦分离筛选了适合于丝绸脱胶的蛋白酶生产菌ZS742,复旦大学郭杰炎等筛选了可用于丝绸脱胶的蛋白酶生产菌弗氏链霉菌。1993年上海市工业微生物研究所杨俊豪等对一株酱油曲霉通过诱变将酶活提高了10倍,发酵罐的液体深层培养酶活力达6000u以上。枯草杆菌1938、栖土曲霉3942及放线菌166是国内生产中性蛋白酶的主要菌种,它们的发酵产酶水平在30多年来的不断改进,有了不少提高。1938的酶活由当初的2～3千个u/mL提高到现在的1～1.2万u/mL,3942由当时3千u/mL提高到现在4～5千u/mL,固体培养为1.5万u/mL以上,166的产酶能力由4千u/mL提高到现在的8千～1万u/mL。4.2　碱性蛋白酶

　　碱性蛋白酶是国内研究得较为广泛和深入的一个酶制剂,1965年上海合成洗涤剂厂从进口洗衣粉首先分离出地衣芽孢杆菌2709,在复旦大学新型发酵厂的协作下,对发酵条件进行研究后,于1971年投入生产,产品除用于加酶洗衣粉外,还用于制革脱毛和毛皮的软化。1975年沈阳林土所、河南省皮革研究所等又分别筛选出酶活较高的碱性蛋白酶生产菌短小芽孢杆菌289和209,发酵约24h产酶活性达5000～6000u/mL,研究表明地衣芽孢杆菌2709和短小芽孢杆菌289碱性蛋白酶均是属卡斯柏格型的蛋白酶,后者对不同蛋白质的水解能力依次是酪蛋白、蛇毒蛋白、人丙种球蛋白、鸡卵清蛋白。1983

4　我国对蛋白酶的研制概况

4.1　中性蛋白酶

　　我国对蛋白酶的研究始于1957年。中科院微生物研究所和原轻工业部工业试验所曾收集和保存了一批酱油酿造用曲霉,肖永澜、方心芳等从117株黄绿色曲霉中筛选出12株蛋白酶活性高的曲霉,其中以栖土曲霉3,374的活性最强。汤汉芬、方心芳、成都生物制品所等将其用于试制蛋白胨。1959年上海市轻工业研究所与红光制革厂合作,进行制革原料皮酶脱毛的研究,笔者将脱脂的带毛皮块直接投入各种曲霉培养物中来筛选适用菌株的方法很快就确定了3,374效果最好。于是在上海酒精厂生产栖土曲霉蛋白酶夫曲作为酶源供制革厂使用,1959～60年间酶法制革在全国一哄而上,不少制革厂也自设车间土法上马进行生产。不久中科院微生物所何秉旺等用紫外线处理栖土曲霉3374得突变株3942,使蛋白酶活力提高28%。李禄先等又筛选出用于丝绸脱胶的芽孢杆菌蛋白酶生产株S114。1964年为配合保定感光胶片厂片基回收用蛋白酶车间建设,中科院微生物所、江苏省轻化工业厅研究所合作,就枯草杆菌1398蛋白酶的生产条件进行详细研究。1965年完成中试后于新建的无锡酶制剂厂投产,1965年上海市工业微生物研究所对栖土曲霉3942蛋白酶的液体和固体培养工艺条件进行了

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年天津市工业微生物研究所徐子渊、郑铁曾等利用人工诱变,从2709选育出突变株C1213,经培养条件优化后,产酶活力达到21000u/mL,凝胶过滤测得其分子量为27600,1991年上海市工业微生物研究所王伟民等,通过原生质诱变,得突变菌株2709A5-B75,在25m3发酵罐产酶活力达到14000u/mL以上而在浙江德清投产。次年中科院微生物研究所那淑敏等从土壤分离出一株地衣芽孢杆菌,经UV、NTG处理,得突变株553F13产酶活力提高20倍,达到10000u/mL,1990年丘秀宝从甘蔗渣中分离出一株嗜碱性短小芽孢杆菌,用NTG反复处理后得到抗利福平突变株SMI-P,在3m发酵罐的产酶活性达18000u/mL,该酶即使在28℃测定活力也有9600u/mL。杨文博等1994年将短小芽孢杆菌C172及其原生质体用物理化学因子处理,得到突变株C172-415,使产酶活力达到13977u/mL。兰州大学薛林贵等(1997)用UV对地衣芽孢杆菌No.53原生质反复多次处理,获得突变株53-C38-6,使产酶活力提高了20倍,达22080u/mL。

　　1995年以来,在利用基因工程和蛋白质工程来定向改造生产菌种的产酶能力和酶的性质,也取得了不少进展,例如利用原生质转化技术将带有糖化型α-淀粉酶基因的PB×96质粒导入受体短小芽孢杆菌C172-60,使之可直接利用淀粉作碳源来生产碱性蛋白酶,利用遗传工程方法构建分泌型高表达碱性蛋白酶的枯草杆菌质粒—宿主系统,利用枯草杆菌碱性蛋白酶E基因信号顺序构建分泌型表达载体等。唐雪明等对碱性蛋白酶工程菌BP071发酵条件优化后,产酶活力达24480u/mL。潘延云等利用原生质体融合法将地衣芽孢杆菌2709与含有碱性蛋白酶基因克隆载体PDW2的工程菌枯草杆菌BD105进行细胞融合得到一株高产菌株A16,发酵产酶比2709高50%～100%,摇瓶试验产酶可达30000u/mL[18]。这是迄今所见我国碱性蛋白酶活力最高的菌株。由于真菌碱性蛋白酶比较容易精制,产品中细菌污染少,真菌碱性蛋白酶的开发引起了人们注意,我国也已有人进行工作,浙江大学应盛华等从稻飞虱尸体上分离出一批冠状耳霉,对其蛋白酶生产条件作了初步研究,笔者以酱油曲霉突变株B用固体培养法生产蛋白酶,其中性蛋白酶活性

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达21600u/g曲(干物),碱性蛋白酶可达30000u/g(干物)。4.3　酸性蛋白酶

　　酸性蛋白酶首先由日本吉田文彦于1954年首先所报道,其产品Molsin在1963年问世。由于通常蛋白酶活性测定是在中性pH下进行的,在此pH下,酸性蛋白酶活性完全丧失,以致苏联科学院士芬尼克莎娃在1959年来华作“食品工业中的酶制剂”报告时曾断言“黑曲霉中是没有蛋白酶的”。为了开展蛋白酶的生产和应用的研究,1960年笔者对收集的40余株曲霉,用麸皮固体培养作成麸曲后,分别用酪蛋白和明胶为底物,在酸性和中性条件下测定蛋白酶活性,结果发现所有黄绿色曲霉无论在酸性或中性下,均可测出蛋白酶的活性,而黑曲霉则只在酸性有强烈的活性,将黄绿色曲霉酶液经pH3,60℃处理30min后再在pH7测定,酶活尽失,而在酸性下测定则活性几无损失。而黑曲霉则酸处理后无损于酶活。

　　1969年上海市工业微生物研究所应新疆建设兵团要求研制酸性蛋白酶以供毛皮软化之用。我们对120多株黑曲霉和柠檬酸生产突变株,用五种培养基进行摇瓶培养筛选,并用麸皮添加铵盐为氮源进行固体培养,结果在固体培养下,有30%的黑曲霉产酸活性可达7000～14000u/g,液体深层培养下黑曲霉3350、3867、宇佐曲霉B1和玉桂色曲霉No.81等均是酸性蛋白酶生产潜力较大的菌种,对黑曲霉3350培养条件详细研究后,于1971年在上海酒精厂投产,发酵液中的酶可用盐析法提取,高活性酶也可用单宁聚乙二醇提取,结合乙醇沉淀法,可得到活性70万u/g,收率65%以上的制品。产品试用于毛皮、制革、啤酒澄清及羊毛染色、医药等方面,均取得了良好的成效。1975年新疆沙漠土壤研究所与科学院微生物研究所合作,对宇佐曲霉B1进行人工诱变,得突变株537,由于产酶活性较高,培养基也较简单,3350的液体培养逐渐被537所取代。1992年浙江省农科院微生物研究所钱玉英等以黑曲霉VanTieghemCpu4为母株,采用Coγ线辐照处理,得突变株6042,酶活提高4倍,固体培养下产酶达18000u/g,干燥麸曲用为猪饲料添加剂,饲养各生长阶段的猪,获得良好效果。固体培养酸性蛋

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白酶中除蛋白酶外还含有半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、植酸酶等与消化有关的酶,其含量因菌株及培养方式而异,以其成本低廉而可取代一部分进口饲料酶。

　　2002年李乃强等就宇佐美曲霉突变株4169的液体培养条件用正交试验进行优化,采用豆饼粉6.0、玉米粉1.5、胨0.7、NH41.0、CaCl2、K2HPO40.4%为培养基,在pH5.5,32℃摇瓶培养80h,酸性蛋白酶活性达8400u/mL。王水顺等从复合饲料角度考虑,对黑曲霉通过诱变得到高产酸性蛋白酶同时兼含丰富纤维素酶与果胶酶的突变株SL-2-111。用麸皮、米糠、豆饼粉以8.25∶4.5∶1.5混合原料,添加硫铵、磷酸盐、氯化钙等营养盐,28～23℃培养60h,固体曲的酸性蛋白酶活性12586u/g,果胶酶和纤维素酶活性分别为16490u/g和9822u/g。谢必峰等将该酶盐析物经SephadexG25脱盐,DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析,Sephacryls-200分子筛和HPLC等方法提纯到电泳纯,测得其分子量为47×103,酶蛋白氨基酸组成为中极性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.5%,极性中性氨基酸占58.5%,其它为非极性氨基酸,N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,序列同源性比对表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性。上述酶学特性资料为该酶在饲料上的应用及进一步研究提供了重要数据。

4.4　低温蛋白酶和耐高温蛋白酶

　　开发低温碱性蛋白酶资源,我国也已做了不少工作,张云波、王跃军等以黄海杆菌YS9412-130为出发菌种,经NTG、EMS、UV与微波处理,得到变异株130-SW1-140,碱性蛋白酶活性提高16倍,20℃测定摇瓶试验酶活为2320u/mL。进一步将SW1-140制备原生质体后再作为复合诱变处理,对大量突变株进行筛选和淡水驯化,最终获得高产株SW2-104,产酶达到3910u/mL,按照设计的中试技术,每吨发酵液可得活力20×104u/g的粗酶20kg。通过一系列纯化,已制备出纯度大于99%的试剂酶,经化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究结果指出,9412-130低温碱性蛋白酶的性质与丝氨酸蛋白酶间有着很大的相似性。

　　陈秀兰等从1855m深海泥样中分离出一株适

冷菌假单孢杆菌SM9915,其所产碱性蛋白酶经纯化发现是由三个最适温度,最适pH不同的组分构成,三种组分最适温度仍40～45℃,故还不属于低温蛋白酶。

　　一般蛋白酶热稳定性不超过50℃,耐热性碱性蛋白酶适合于碱性,高温的工艺过程,故也受到人们所关注。吴梧桐、阿吉多雷等由新疆沙漠土样分离获得的栗褐芽孢杆菌CPU(B.badiumCPU9407),在pH9下,37℃培养,可产生最适pH9.5温度57℃的碱性蛋白酶,酶活5800u/mL,这种酶50℃加热60min酶活基本不变,50℃3h酶活下降44%。　　2003年活泼等从新疆吐鲁番土壤分离到一株耐热性芽孢杆菌XJT9503,该菌在最适温度46℃摇瓶培养60h生产中型蛋白酶,65℃测定酶活5300u/mL。

5　结束语

　　我国的酶制剂工业经过40多年来几代人的努力,已具备一定的规模和水平。无论是酶的品种、产量和发酵水平上都有很大提高,个别酶制剂的发酵活力还达到国际领先水平。蛋白酶是一种用途广泛的酶制剂,各种蛋白酶已广泛使用在我国工农业生产的各方面,有力地促进了有关行业的发展,但总体来说与国际先进水平相比各方面还有相当差距。　　就我国酶制剂的科研、生产和应用开发而言,不少是低水平的重复,缺乏开拓创新,主要几个酶制剂的生产菌种不少是从进口样品中分离或引进或嫁接过来的,通过几个五年计划的攻关,也填补了一批空白,重点是提高酶的发酵水平。但有些成果经过鉴定或验收,也就是宣告该研究结束之日而不再深入提高。以致不少酶制剂不论是质量和生产技术还是赶不上国外先进水平,有些酶继续要靠进口,一些酶全国兴师动众一哄而上的研究,最终还得靠进口,造成莫大的浪费。

　　我国酶制剂的研究主要集中在已有菌种产酶力的提高而较少重视新的应用和开发,酶制剂工业有其特殊性,酶的生产和酶的应用相辅相成,一个新酶品种的诞生需要先有了酶才谈得上开发应用,有了应用市场,才能拉动酶的生产,从事酶制剂的科研人员负有研制和应用开发的双重任务。

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　　我国现有“酶制剂”实际上不少还只是酶的粗制品,严格说来还不是“制剂”。就国外Novozymes公司来说,供应的蛋白酶就有十多个品种,同一种制革用的酶还细分为浸水用酶、脱毛用酶、浸灰用酶等专用酶,因为他们的酶经过了纯化,对其性能了如指掌,然后复配而成。在饲料酶方面也是如此。我国的饲料酶大多数还是麸曲,成份非常复杂。　　改革开放以来,与跨国公司的合资,给我国酶制剂行业带来了新的经营理念和成熟的先进技术,但随着外资比例的不断增加,国资方的自主权也变得愈来愈小,这些企业依靠外国现成技术,不须进行研发,而一些国资中小企业则也因转制等原因,不愿对研发付出较多的投入,以致近年来我国酶制剂行业的研发力量大为萎缩,积极性也大大削弱。虽然一些大学对酶的研究特别是碱性蛋白酶怀有较大兴趣,但研究人员主要的依靠是研究生,论文完成走人,即使有后续研究连贯性也不强。以致真正转化为生产力的还较少。这些问题需要有关部门和行业制定规划时加以注意。　　菌种的产酶力和酶的性能对降低成本,扩大市场有重要意义。我国在上世纪80年代以前,诱变育种是提高产酶力的主要手段,并取得了很大成绩。随着基因工程的普及,我国在纤维素酶和碱性蛋白酶的研究上也取得了很大成效,利用蛋白质工程来提高酶的稳定性和改善酶的性质的工作也在进行,相信随着工作的深入和知识的积累今后会有所突破。这些新技术已成为我国生物技术界人气最旺盛的领域,但是忽视常规微生物分离和筛选技术提高的倾向也是不可取的,新技术都离不开这些基础手段。随着高通量筛选技术的确立,筛选效率得以大大提高。据说地球上的霉菌有150万种,细菌有3万种,目前已经认识的仅占5%和10%,而在已经认识的2000多种(一说5000多种)酶中,可供产业应用的还只有150种,大量的酶的开发应用还得需要用基础的常规方法。

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(1.ShanghaiInstituteofIndustrialMicrobiology,Shanghai200233;

2.ShanghaiResearchCenterofBiotechnology,ChineseAcademyofScience,Shanghai200233)

Abstract　Proteaseisoneofthemostimportantenzymeswithextensiveusesinalotoffields.Inthisarticle,theclassificationandspecifityofproteaseanditsproductionandapplicationsbothathomeandabroadwereoutlined.Keywords　protease;production;application

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