E.Z.N.A. Endo-free Plasmid Mini Kit 中文操作说明

1. 在10-20mL管内注入5mL LB/ampicillin(50ug/mL)培养基，接种带有目的质粒的大

肠杆菌，37℃振荡培养12-16h

2. 取1.5-5mL菌液于合适的离心管中， 10000×g室温离心1min，收集菌体沉淀 3. 小心除去上清，加250uL SolutionⅠ /RNase A，涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌

体，这一步对提高质粒产量至关重要

4. 加250uL的 SolutionⅡ，轻轻来回颠倒混匀4-6次，得到澄清的裂解液。在室温孵

育2min是必要的，但不要用力摇晃否则降低质粒纯度

5. 加125uL的预冷Buffer N3（提前置于冰上），颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉

淀，≥12000×g室温离心10分钟（4℃更好）

6. 小心移上清至干净的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution。颠倒混匀

7-10次，在冰上孵育10min，孵育过程中可颠倒几次。注：加入ETR Solution后，溶菌产物会变浑浊，但是冰上孵育后变澄清

7. 42℃孵育5min，溶菌产物再次变浑浊，12000×g 25℃离心3min。ETR Solution

会在管底呈现蓝色分层

8. 转移上清至新的1.5mL离心管中，加入0.5倍体积96%-100%的乙醇(室温)，颠

倒混匀6-7次，室温孵育1-2min

9. 取第8步混合液700uL加入到一个干净的HiBindTM DNA Mini 柱装配与2mL的收集

管内（试剂盒提供），10000×g 室温离心1min过柱 10. 弃滤液，将第8步剩余混合液离心过柱如上

11. 取500uL Buffer HB洗柱，离心过柱如上。注：这步是为了去除残留的蛋白质，并

得到高质量的质粒

12. 弃滤液，加700uL DNA Wash Buffer洗柱，离心过柱如上，弃滤液。注：浓缩的

DNA Wash Buffer使用前需按照标签提示用无水乙醇稀释 13. 重复第12步，再加入700uL DNA Wash Buffer

14. 弃滤液，将空柱子套回离心管，以最大转速（≥13000×g）离心2min，干燥柱子。

注：这一步是为了除去残留的乙醇

15. 将柱子套在一个新的1.5mL离心管中，取30-50uL Endotoxin-Free Elution

Buffer(或者水)直接打在柱子上，以最大转速（≥13000×g）离心1min洗脱质粒。注：一次可洗脱约70%-85%的质粒，可再洗一次，但会降低质粒浓度。