聚丙烯酰胺凝胶电泳
Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE 一、PAG 的 组成
PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。 Acr + Bis-----? 多孔三维网状结构 ? （1）丙烯酰胺结构式 （2）亚甲双丙烯酰胺 二、PAG 的 聚 合
需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 （一）化学聚合：AP-TEMED系统
过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。
TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。 注意：
?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 ?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 （二）光聚合：核黄素-TEMED系统
核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意：
分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。 三、PAG的浓度与孔径的关系
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。
Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性； ＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。 凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100%
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。
常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。
C=b/（a+b）×100%
当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。 四、不 连 续 PAGE 按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE 电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 样品胶为T=3% C=20%单体
欲分离的样品溶液 pH6.7 Tris-HCl缓冲液
混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶
浓缩胶：除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同 分离胶：T=7%C=2.5%单体溶液 pH8.9 Tris-HCl缓冲液 化学聚合法聚合成小孔胶 分 离 原 理 1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同?孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。 2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（?）很小，有效迁移率（M ?）很低，移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，?=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。 快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。 3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离 凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面. 五、PAGE 的 特 点 1.具有分子筛效应，分辨率高 2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明 6.网孔可调节 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（实验） [原理] 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由两种以上的缓冲液、pH值及不同的浓缩胶和分离胶组成，而连续电泳系统则仅由均一孔径的、同一浓度的凝胶所组成。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应，而连续电泳系统电泳分离过程中则不具备浓缩效应。本次实验采用连续电泳系统PAGE，通过分子筛效应和电荷效应，将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。 [器材] 1.电泳仪 2.凝胶玻管 3.三角烧杯 4.长针头 [试剂] 1.分离胶缓冲液：Tris 6.057g， EDTA 1.17g，加蒸馏水至100ml，调节pH至8.8 2.单体交联剂：Acr 30.0g，Bis 0.8g，加蒸馏水至100ml，4℃冰箱保存。 3.加速剂：四甲基乙二胺（TEMED） 4.催化剂：10%过硫酸铵（AP） 5.电极缓冲液：0.4M硼砂缓冲液 6.样品稀释液：分离胶缓冲液25ml+蔗糖10g+0.05%溴酚兰5ml，加蒸馏水至100ml。 7.样品液：样品稀释液1.9ml+血清0.1ml 8.固定液：12.5%三氯醋酸 9.染色液：考马斯亮蓝 R-250 0.5g加90%乙醇90ml，冰乙酸 10ml， 用时稀释4倍。 10.洗脱液： 冰乙酸38ml加甲醇125ml，加蒸馏水至500ml。 11.保存液：7%冰乙酸 [操作] 1. 凝胶的制备 （1）取玻管一支插入橡皮垫，垂直置于桌面上 （2）配制分离胶，取三角烧杯，按下列程序加入各液，摇匀。总体积10ml，凝胶浓度为7.5%。 分离胶缓冲液 1.0ml 单体交联剂 2.1ml 蒸馏水 6.8ml AP 0.1ml TEMED 0.01ml （3）用滴管吸取分离胶沿壁加入凝胶至距玻管上端2.5cm处，小心在凝胶液上盖一层蒸馏水，加水时尽量避免冲击凝胶表面，待凝胶聚合后，倾去覆盖的水。 2. 电泳 （1）将凝胶玻管安装在电泳槽上槽圆孔中，使凝胶顶部恰好可见； （2）将电极缓冲液分别注入上、下槽中，并赶去凝胶玻管中的气泡。上槽应浸没凝胶玻管，下槽液面应超过凝胶管下端。 （3）用微量注射器取样品10~15?l，沿玻管壁加在凝胶面上，注意加样速度要慢，以不激起电极缓冲液为佳。 （4）上下槽分别接负、正极，通电，开始用1~2mA/管，2分钟后增至3~5mA/管，示踪染料进入分离胶时，调节电流为2mA/管。直到示踪染料达到距管下口约0.5cm，断电。 3.剥胶： 取下凝胶管，不要将玻管内的电泳液弃去，将长针头插入凝胶柱与管壁之间，旋转胶管，直到胶柱与管壁分开，用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便徐徐从胶管中滑出。 4.固定、染色 将凝胶柱浸泡于12.5%三氯醋酸中0.5~1小时，然后转入染液中染色1~2小时，或90℃水浴中染色10 分钟。 5.脱色、保存 将已染色的凝胶柱置于7%醋酸溶液中浸洗，直到浸洗到染液无色为止。 6.观察结果 等 电 聚 焦 电 泳 Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE 一、定义
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