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饱和。
四、〖大孔吸附树脂的吸附条件和解吸附条件的选择〗
吸附条件和解吸附条件的选择直接影响着大孔吸附树脂吸附工艺的好坏 ,因而 ,在整个工艺过程中应综合考虑各种因素 ,确定最佳吸附解吸条件。
影响树脂吸附的因素很多 ,主要有被分离成分的性质(极性和分子大小等) 、上样溶剂的性质 (溶剂对成分的溶解性、盐浓度和 pH值) 、上样液浓度及吸附流速等。通常 ,极性较大分子适用中极性树脂上分离 ,极性小的分子适用非极性树脂上分离;体积较大化合物选择较大孔径树脂 ;上样液中加入适量无机盐可以增大树脂吸附量;酸性化合物在酸性溶液中易于吸附 ,碱性化合物在碱性液中易于吸附 ,中性化合物在中性液中吸附;一般上样液浓度越低越利于吸附;对于滴速的选择 ,则应保证树脂可以与上样液充分接触吸附为佳。
影响解吸条件的因素有洗脱剂的种类、浓度、pH值、流速等。洗脱剂可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等 ,应根据不同物质在树脂上吸附力的强弱选择不同的洗脱剂和不同的
洗脱剂浓度进行洗脱 ;通过改变洗脱剂的 pH 值可使吸附物改变分子形态 ,易于洗脱下来;洗脱流速一般控制在 0. 5～5ml/ min。
大孔吸附树脂的孔径和比表面积是影响大孔吸附树脂对中草药有效成分吸附的主要因素。大孔吸附树脂比表面积越大,单位质量大孔吸附树脂与中草药有效成分作用的面积越大,单位质量大孔吸附树脂吸附的有效成分量越大。同时大孔吸附树脂对有效成分作用面积受大孔吸附树脂孔径的影响。大孔吸附树脂表面积由树脂外表面积和树脂部孔网形成的表面积组成。当树脂孔径小于吸附的有效成分分子时,有效成分分子不能进入树脂部,只能吸附在树脂外表面;当树脂孔径大于有效成分分子时,有效成分既可以吸附在树脂外表面也可吸附在表面。综合孔径和比表面积作用结果,当树脂孔径较大,大孔吸附树脂比表面积越大,吸附量越大。
吸附工艺对有效成分在大孔树脂上吸附效果的影响。黄酮、皂苷、生物碱等中草药有效成分加入大孔吸附树脂层析柱后,通过德华力或氢键等分子间作用力吸附在大孔吸附树脂上。同时黄酮、皂苷、生物碱等成分与溶液作用溶解在溶液中。黄酮、皂苷、生物碱等有效成分在大孔吸附树脂上的吸附和解吸是大孔吸附树脂吸附和溶液溶解相互作用相互竞争的结果。当分子间作用力产生的吸附作用占优时,有效成分吸附在树脂上;当溶液的溶解作用占优时,有效成分从树脂上洗脱。
进柱液pH值对大孔吸附树脂提取有效成分效果的影响。改变溶液pH值,可以影响中草药有效成分在大孔吸附树脂上的吸附。溶液pH值对有效成分在大孔吸附树脂上吸附影响体现在以下几方面。首先,溶液pH值变化可以改变有效成分在溶液中存在的形式。例如,生物碱在碱性溶液中以游离态形式存在,而在酸性溶
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液中以离子形式存在。再次,溶液pH值改变可以影响有效成分在溶液中的溶解度。例如:溶液pH值升高皂苷在溶液中的溶解度增大。最后,溶液pH值变化改变溶液极性,影响有效成分和大孔吸附树脂间的分子间作用力。对生物碱等碱性有效成分,将溶液变成酸性,改变生物碱等碱性成分在溶液中的存在形式,提高其在酸性溶液中的溶解度,降低其在大孔吸附树脂上的吸附。宓晓黎等使用非极性大孔吸附树脂分离复方降压胶囊中的生物碱,研究发现随溶液pH增加,生物碱的吸附量增加。黄酮、皂苷和其他苷类是中性或弱酸性物质,提高溶液pH值,提高溶液中的溶解度同时增加有效成分与大孔吸附树脂之间分子间作用力。高红宁等研究发现苦参黄酮在AB-8上的吸附量随pH值增加,先增加后降低,存在最佳pH值对应最高的吸附量。立等研究不同大孔吸附树脂吸附洋地黄中强心苷,随pH值增加,溶液pH在6-7时,吸附量急剧增加;pH值大于7时,吸附量不变或降低。孟琴等研究pH值对大孔吸附树脂吸附紫草宁的影响发现在酸性条件下,吸附量大,在碱性条件下,吸附量小。酸性有效成分应该在酸性条件下吸附,碱性有效成分应该在碱性条件下吸附。反之在解吸洗脱阶段,酸性有效成分使用碱性洗脱液效果更好;碱性有效成分使用酸性洗脱液洗脱效果更佳。
温度对大孔吸附树脂提取有效成分效果的影响。由于黄酮、皂苷、生物碱等有效成分在大孔吸附树脂上的吸附是通过分子间作用力,属于物理吸附。温度升高,一方面有效成分在树脂上的吸附作用降低,另一方面,有效成分在溶液中的溶解度增大。综合结果温度升高有效成分在大孔吸附树脂上的吸附速度和吸附量降低。雁群比较了在15℃和65℃下AB-8树脂对罗汉果中皂苷的吸附速度,发现在低温下吸附速度更快。剑君等使用AB-8树脂吸附根素,绘制了15℃、30℃、50℃条件下的吸附等温度曲线,认为温度升高根素吸附量减少。所以在吸附阶段,应该降低温度;反之,在解吸洗脱阶段,应该升高温度。
有效成分初始浓度对吸附的影响。黄酮、皂苷、生物碱等在大孔吸附树脂上是物理吸附,从物理吸附等温方程可以发现,初始浓度增加,平衡吸附量增加,吸附率降低,平衡吸附时间增加。剑君等使用AB-8树脂吸附根素,研究吸附等温曲线认为根素初始浓度增加,吸附率反而减少。立等研究不同进柱液浓度对大孔吸附树脂吸附洋地黄中强心苷的影响,发现进柱液浓度液增加,平衡吸附时间延长,吸附量增加,吸附率降低。
洗脱液性质对大孔吸附树脂提取有效成分效果的影响。将中草药有效成分从大孔吸附树脂上洗脱,是利用有效成分在洗脱液中的溶解作用大于有效成分和大孔吸附树脂间的吸附作用。使用的洗脱液应该对有效成分具有良好的溶解作用。黄酮、皂苷、生物碱以及其他苷类物质在乙醇等醇类溶液中溶解度较大。常使用乙醇作为洗脱液。乙醇溶液浓度从两方面影响有效成分在大孔吸附树脂上的吸附。一方面,乙醇浓度不同,乙醇溶液极性不同,影响有效成分和大孔吸附树脂间的分子间作用力。另一方面,乙醇浓度不同,影响有效成分在乙醇溶液中的溶解度。不同浓度乙醇液影响有效成分在大孔吸附树脂上的解吸作用是两种作用相互竞争的结果。田晶等使用AB-8树脂吸附大豆豆皂苷,研究得到洗脱液中总皂苷含
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量随洗脱液乙醇浓度增加,先增加后降低。在乙醇浓度为50%时,洗脱液中总皂苷含量最大,而其他的糖类和蛋白较少。
盐效应 中药有效成分受盐效应的影响，在提取溶液中被纯化成分的溶解度下降，有利于树脂吸附，使吸附量增加。盐效应因盐的种类与用量的不同而有所不同。侯氏等在作盐溶液对吸附纯化效果考察时，发现不同浓度的氯化钠、高浓度的氯化钾可以提高指标成分的比上柱量，低浓度的氯化钾则会降低其比上柱量；曾氏等在绞股蓝总皂苷提取工艺的研究中对加盐（氯化钠）的浓度作了考察，认为氯化钠浓度越高，树脂对总皂苷的吸附能力越强。氏在作氯化钠对紫色素在S-8大孔吸附树脂纯化效果研究中认为，氯化钠对紫色素在S-8大孔吸附树脂上的吸附有明显的促进作用，但是，这种作用并不是与氯化钠的浓度呈完全的线性关系。汤氏等在对牛磺酸在大孔吸附树脂上的吸附－解吸行为研究中认为，盐效应对牛磺酸在S-8和D4020树脂上的吸附行为影响不大。
五、〖大孔吸附树脂的吸附〗
1. 吸附洗脱特性参数的测定
比上柱量（Saturation ratio，S）：达到吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成份的总和，S=（M上－M残）/M，表示树脂吸附承接的总体能力 ，S越大，承接能力越强。是确定树脂用量的关键参数。
比吸附量（Adsorption ratio，A）：单位质量干树脂吸附成份的总和，A=（M上－M残－M水洗）/M，表示树脂真实吸附能力，A越大吸附能力越强，是选择树脂总类与评价树脂再生效果的重要参数。
比洗脱量（Eluation ratio，E）：吸附饱和后，用一定量溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，E=M洗脱/M，表示树脂的解吸附能力与洗脱溶剂的洗脱能力。E越大表示洗脱溶液剂的洗脱能力与树脂的解吸附能力越强，是选择树脂及洗脱溶剂的重要参数。其中M为干树脂质量，M上是上柱液中指标成分的质量，M残是过柱流出液中指标成分的质量，M水洗为水洗液中指标成分的质量，M洗脱为洗脱溶剂中的指标成分的质量。
侯氏等在对大孔吸附树脂纯化中药有效成分影响因素考察时，提出了反映药物在吸附前、吸附后、解吸附后全过程的3个概念：比上柱量、比吸附量、比洗脱量。3个参数均以单位质量干树脂计，提高了评价指标的准确性与科学性，便于估算树脂用量，利于工业化生产。 比上柱量：达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和，表示树脂吸附、承载的总体能力，4 越大则承载能力越强，是确定树脂用量的关键参数。
比吸附量：单位质量干树脂吸附成分的总和，表示树脂的真实吸附能力，. 越大则吸附能力越强，是选择树脂种类与评价树脂再生效果的重要参数。
比洗脱量：吸附饱和后，用一定量溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，表示树脂的解吸附能力与洗脱溶剂的洗脱能力，比洗脱量越大表示洗脱溶剂的洗脱能力与树脂的解吸附能力越强，是选择洗脱溶剂的重要参数。
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此外，还常用到以下2个指标评价树脂的吸附与解吸附能力。吸附率：吸附前后样品溶液浓度之差占上柱前样品溶液浓度的百分率；解吸率：洗脱剂中样品的量相对于树脂吸附量的百分率。
2. 树脂型号、树脂用量和洗脱剂的确定
将红花按提取所得之提取液合并（药材羟基红花黄素A含量6.25%），测得其中羟基红花黄素A含量为 7.628 mg·mL-1。
取HPD100、CAD40、HPD 600及860021型树脂，用红花提取液上柱，先用水洗，再用不同浓度的乙醇洗脱，分别收集过柱残液、水洗液、乙醇洗脱液，分别测定其中羟基红花黄素A含量，并计算有关的特性参数，结果见表3-6。
表3-6 不同型号树脂吸附纯化特性参数
Saturation ratio
Resin model HPD 600 CAD 40 HPD 100 860021
Material（g/g） 0.215 0.072 0.110 0.298
HSY-A（mg/g）
13.45
4.50 6.86 18.65
Adsorption ratio HSY-A(mg/g) 11.08 1.80 1.82 15.82
Eluation ratio HSY-A(mg/g) 11.50 1.39 2.18 2.29
由表3-6结果可知，以羟基红花黄素A为指标成分，红花提取液在不同树脂上具有不同的吸附、洗脱效果，其中CAD 40 和HPD 100型树脂比上柱量较小； HPD 600和860021型号树脂的比上柱量及比吸附量均较大，但是860021用30%乙醇洗脱时的比洗脱量小, 即样品损失严重，HPD 600型树脂的比上柱量较大且比洗脱量大，吸附洗脱性能很好。综合比较，决定选用比吸附量较大、比洗脱量也大的HPD 600型树脂，同时确定洗脱液为30%乙醇。
根据所测得HPD 600型树脂的比上柱量，折算每L湿树脂可承载约0.2 kg红花药材的提取液，考虑到红花药材羟基红花黄素A含量高，并且兼顾生产工艺和药材含量的变化，决定上样量用每L湿树脂承载0.1 kg红花药材的提取液。 3. 水洗量的确定
用不同柱体积的水洗脱上样的HPD 600大孔树脂柱，同时测定水洗液中羟基红花黄素A含量及观察颜色，结果见表3-7。
表3-7 水洗量的确定实验结果
Vol. of water（vol. of clomn）
Weight of eluent（mg）
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1 145.3
2 22
3-4 18
5-6 16
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Content of HSY-A（mg·mL） 1.75 11.91 Color of eluent Deep brown Yellow
-1
19.0
Yellow 19.1 Yellow
根据实验结果，1倍柱体积水洗柱即可将大部分的杂质除去，进一步洗脱将损失有效成分羟基红花黄素A。为此，本工艺采用1倍柱体积水洗柱除杂质。 4. 洗脱剂用量的确定
取上述达到饱和并经水洗的树脂柱，用30%乙醇洗脱，分段收集，测定其中红花黄素A的含量，计算比洗脱量及洗脱率，其结果见表3-8。
洗脱率 =
洗脱液中HSY-A的含量（mg） 被吸附于树脂上HSY-A的量（mg） Corresponding colemn vol. （times） No.1-2 No.3-4
Content of HSY-A
-1
（mg·mL） 0.831 0.094
× 100%
表3-8 洗脱剂用量的考察 Vol. of eluent （mL） 40 40
Content of Eluention HSY-A（mg） ratio
（%）
33.24 79.2 3.76 9.0
由上述结果可知，用相当于4个柱体积的30%乙醇洗脱时，指标成分羟基红
花黄素A的洗脱转移率近88.2 %，几乎全部从柱上解吸下来。而且，第3-4体积洗脱液中羟基红花黄素A含量明显下降（仅为第1－2体积的10%左右），考虑到工业化生产效率，因此，洗脱剂的用量确定为4个柱体积。 5. 吸附泄漏点的检查
取洗脱液10 mL减压浓缩至1 mL左右，滴1滴在滤纸上，呈现鲜黄色斑点，紫外灯（365nm）下显亮黄色荧光，氨气薰后，斑点转为橙黄色，紫外灯（365nm）下显亮橙色荧光；另取浓缩样品滴1滴在滤纸上，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，显现橙黄色斑点，紫外灯（365nm）下显亮橙色荧光。即为样品在树脂上超载。 6. 吸附及洗脱流速的确定
分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml/cm3/min 的流速上样并检查泄漏，发现当流速4.0 ml/cm3/min，有可能产生吸附不好而出现泄漏现象，为保吸附完全，兼顾效率，故确定上样流速为1.0-2.0 ml/cm3/min之间。继分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml/cm3/min 的流速洗脱，发现以4.0 ml/cm3/min 的流速洗脱4个保留体积后，洗脱液中仍然可以检出羟基红花黄素A，而低于3.0 ml/cm3/min 的流速几乎检不出羟基红花黄素A，因此确定洗脱流速为1.0-2.0 ml/cm3/min之间。
六、〖大孔吸附树脂的工艺验证〗
根据以上大孔吸附树脂吸附洗脱性能研究的结果，确定红花黄素制备工艺孔吸附树脂吸附、纯化的最佳工艺条件为：选用HPD 600型树脂，树脂用量为0.1 kg药材∶1L湿树脂，先用1个柱体积水冲洗，弃去水洗液，再用4个柱体积的30%乙醇洗脱，收集醇洗脱液。
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