黔南民族师范学院《微生物学实验》 课程教案
NO:19-21学时 2014年4月14日 第7周 周1 5～7学时 第一实验楼微生物实验室 授课实验五 微生物大小测定、显微镜直接计数和悬滴观察 题目 课时安排 3学时 教学 2．学习并掌握利用血球计数板测定微生物细胞数的原理和方法； 目的 3．学习并掌握微生物的悬滴观察方法 要求 4. 巩固显微镜使用技术。 教学重点难点 学习重点：细菌革兰氏染色的原理和方法。 学习难点：革兰氏染色关键技术的掌握。 1．学习并掌握利用显微测微尺测量微生物大小的方法； 教 学 内 容 及 时 间 安 排 方法及手段 1 显微测微尺测量微生物细胞大小； 2 血球计数板测定微生物细胞数 3 微生物的悬滴观察 实践教学 作业布置： 按要求完成实验报告。 备注： 23
实验五 微生物大小测定、显微镜直接计数和悬滴观察
1 目的要求
1.1 学习并掌握微生物细胞大小测定的原理和方法；
1.2 学习并掌握利用血球计数板测定微生物细胞数的原理和方法； 1.3 学习并掌握悬滴法观察细菌的运动。
2 原理
2.2 显微测微尺测量微生物大小的原理
因为微生物的个体通常只在显微镜下可见，所以其大小测量也应在显微镜下进行。用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分刻有精确等分线的载玻片。全长1mm，等分为100小格，每一小格长为10μm，见图5-3。目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上，有等分50小格和100小格两种，每5小格间有一长线相隔。当将此测微尺放在目镜内观察物象时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放大倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。
图5-1 用镜台测微尺校正目镜测微尺
2.2 血球计数板测定微生物细胞数的原理
计算单位体积内微生物细胞数目的方法很多，有平皿培养法、光密度法、血球计数法等，其中后者具有直观、简便和快速等优点。其原理是：将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm），所以可将在显微镜下计得的细胞数（菌数或孢子数）换算成单位体积试样中的菌数。由此法得到的是死菌和活菌的总数。血球计数板是一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。如图5-2所示。计数室方格的边长为3mm，每个方格分为9个大方格，正中央的大方格被分为25个中方格，每个中方格又被分为16个小方格（有的大方格被分为16个中方格，每个中方格又被分为25个小方格），无论哪种规格的计数板正中央的大方格都分成400个小方格（图5-3）。1个大方格的边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm,盖上盖玻片计数室的高度为0.1mm，即计数室的容积为0.1mm（10mL）。
计数时，一般数5个中方格的总菌数，计算每个中方格的平均数，再乘以25或16（25或16个中方格），得到一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。计算公式如下（25个中方格为例）：
1mL菌液中的总菌数（个）= 5个中方格中的总菌数/5×25×104×稀释倍数
2
3
-4
3
图5-2 血球计数板的构造 a.平面图（中间平台分为两半，各有一个计数室） 图5-3 血球计数板中央大方格的刻度
b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙） （25中格×16小格）
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2.3 悬滴法观察细菌的运动
用凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后反转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央，细菌可在其中自由运动。
3 材料与器具 3.1 菌种
（1）金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） （2）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） （3）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） （4）苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） （5）十字花科软腐病菌（Erwinia aroideae） （6）大肠杆菌（Escherichia coli） （7）坚黑粉菌（Ustilago hordei） 3.2 其它
血球计数板，显微目镜测微尺,显微镜台测微尺，凹玻片，凡士林，盖玻片，无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，振荡器。
4 内容及方法步骤
4.1 显微测微尺测量微生物大小 （1）校正目镜测微尺：
①安装目镜测微尺：取出目镜，旋开透镜螺旋，将目镜测微尺刻度朝下放入目镜筒，然后旋好螺旋，插入显微镜筒（图5-4）；
②置镜台测微尺：将镜台测微尺放在载物台上，使刻度面朝上；
③校正：在显微镜下观察，调准焦距，当看清镜台测微尺后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，然后移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两条刻度线完全重合，再数出两条重合线间各自所占的格数，根据公式得到校正后的目镜测微尺每小格的长度。见图5-1。分别在低倍镜、高倍镜和油镜下校正目镜测微尺。
目镜测微尺每小格长度（μm）= 两条重合线间镜台测微尺的格数×10
两条重合线间目镜测微尺的格数
图5-4 安装目镜测微尺
将目镜测微尺的校正结果填入表5-1。
表5-1 显微镜目镜测微尺刻度的校正结果 目镜放大倍数：
物镜 低倍镜 高倍镜 油 镜
物镜倍数
目镜测微尺格数
镜台测微尺格数
目镜测微尺每格代表的长度（μm）
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（2）酿酒酵母细胞大小测定
①制备菌悬液：向酿酒酵母菌斜面内加入10mL 无菌水，用无菌接种环刮下菌苔后，充分振荡，
－3
然后适当稀释至10，待用；
②制酿酒酵母水压片：取一洁净载玻片，在中央滴1 滴菌悬液，小心盖上盖玻片，用吸水纸将多余的液体吸干，千万不要产生气泡；
③测量酿酒酵母菌体大小：将酿酒酵母水压片放在载物台上，在显微镜下看清菌体后，转动目镜测量酵母细胞菌体的直径。分别在低倍镜、高倍镜和油镜进行测量，每次测量10个细胞；
④整理：取下目镜测微尺，擦净后收好。 ⑤结果报告
将高倍镜下测量的结果填入下表5-2。
表5-2 酿酒酵母或坚黑粉菌细胞大小的测量结果
菌细胞编号 目镜测微尺格数 细胞直径μm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
平均值
（3）细菌细胞大小测定
①制备细菌涂片 取一干净的载玻片，滴一滴无菌水在其中央，无菌操作下，用接种环挑取适量细菌菌落于无菌水中，充分混匀得菌悬液，过火焰固定。
+-②简单染色 G菌用结晶紫染色，G用番红染色，干燥后油镜观察。
③整理 取下目镜测微尺，擦净后收好，显微镜用二甲苯清洗。
表5-3 金色葡萄球菌细胞大小的测量结果
菌细胞编号 目镜测微尺格数 细胞直径μm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
平均值
表5-4 枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌或大肠杆菌细胞大小的测量结果
菌细胞编号 目镜测微尺格数 细胞宽度μm 细胞长度μm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
平均值
④结果报告 观察结果分别填入表3、表4，并将下列问题融入讨论中
①在一台显微镜上标定的目镜测微尺长度，当换用另一台显微镜时其长度是否有效？ ②为什么在测量微生物细胞大小时要多取几个样本测量？
③试分析活细胞与经染色的细胞大小有无区别？ 4.2 血球计数板测定微生物细胞数 4.2.1酿酒酵母细胞数测定
（1）制备菌悬液 向酿酒酵母菌斜面或干酵母粉，加入10mL无菌水，充分振荡，然后适当稀释-3
至10，待用。
（2）加菌液 先用擦镜纸将血球计数室擦净，用无菌滴管取少许酿酒酵母菌稀释液滴入上下两个计数室内，盖上专用的盖玻片，绝对不能有气泡，否则重做。
（3）计数 先在显微镜下找到计数室，在正中央的大方格中沿对角线取9个中方格，计数每个中方格的菌数。
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