整个基因克隆实验流程(完整)

3’RACE

（dT）17-接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 17 3’ 接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CG 3’ 1. cDNA的合成 DEPC水 9.75μl OligodT接头引物 1μl Total RNA 2μl (<1000ng) 65℃,5min；立即置于冰上。 第一步变性后的RNA溶液 12.75μl 5×RT Buffer 4μl dNTP Mixture（各10mM） 2μl Rnase Inhibitor（40U/μl） 0.25μl ReverTra Ace 1μl 总体积 20μl 反应条件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。 2. cDNA的纯化

利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20μl TE洗脱沉淀。

3. 第一轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl OligodT接头引物(10μmol/L) 0.4μl 3’RACE外引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。 PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。 4. 第二轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl 接头引物(10μmol/L) 0.4μl 3’RACE内引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。

5’RACE

1. cDNA的合成 DEPC水 9.75μl 基因特异性反义引物 1μl Total RNA 2μl (<1000ng) 65℃,5min；立即置于冰上。 第一步变性后的RNA溶液 12.75μl 5×RT Buffer 4μl dNTP Mixture（各10mM） 2μl Rnase Inhibitor（40U/μl） 0.25μl ReverTra Ace 1μl 总体积 20μl 反应条件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。 2. cDNA的纯化

利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20μl TE洗脱沉淀。

3. cDNA的加尾 纯化后的cDNA 5.7μl 5×末端转移酶缓冲液 2μl 1mmol/l dATP 2μl 末端转移酶（30U/μl） 0.3μl 总体积 10μl 反应条件：37℃,60min；70℃，10min。反应结束，把cDNA稀释1倍作模板进行下游实验。 4. 第一轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl OligodT接头引物(10μmol/L) 0.4μl 5’RACE外引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。 PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。 5. 第二轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl 接头引物(10μmol/L) 0.4μl 5’RACE内引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl

ddH2O 反应条件：降落PCR。 6.0μl