的话就接着做一个β- gal。所以有的人同时转化两种菌种。这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。
之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。
三. α和β-gal实验：（我就做β
-gal试验，要注意如果做β-gal的话，这
时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页）
1.试剂： 2.原理：
? ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯
酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。
? Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。（Na2CO3在配制时，不需要高压）
3.实验方法
一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）
a) 将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。 b) 准备Z buffer/X-gal 溶液。
c) 为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman 滤纸，置于100mm或150mm无菌
平板中用2.5-5ml Z buffer/X-gal 溶液浸泡。
d) 用无菌的镊子小心地将无菌Whatman 滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有
部分沾到滤纸上。
e) 用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。
f) 滤纸放入液氮中0.5～1min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。 g) 小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意两层滤纸中间不
要有气泡。
h) 平板放到30℃培养箱中，观察其是否变蓝。一般阳性克隆在0.5～8h内会变蓝，超过
8h容易产生假阳性结果。
二 . Liquid Culture Assay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验） 1) 在合适的SD培养基中制备5 ml过度培养物。
注意：你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。
2) 在进行实验当天，将ONPG以4 mg/ml 的浓度溶于Z buffer中，振荡1～2h确保完全
溶解。
3) 大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml
(2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加） 4) 30℃培养3～5h（230-250 rpm）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8
之间）在收获细胞的同时记录OD600值。
注意：在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块 5) 各吸取1.5 ml（0.5 ml）培养物到各3个1.5 ml离心管（每个管子就是1.5ml），离心14000
rpm/30sec。
6) 小心移去上清，加上1.5 ml（0.5 ml）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。
7) 再次离心并移去上清，加上300ul（100 ul）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。
这样，终浓度就是1.5/0.3 = 5倍。
注意：在这个清洗步骤之后，细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来纠正。 8) 转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。
9) 将细胞置于液氮中（约0.5～1min）直至细胞冰冻。 10) 将离心管放于37℃水浴中0.5～1min使其融化。 11) 反复冻融3次（重复9和10步）确保细胞裂解。 12) 用100 ul Z buffer.来设置一个空白对照。
13) 加0.7 ml 的Z buffer 与β-巯基乙醇到反应管和空白管中
注意：在冰冻之前不要加Z buffer
14) 立即加160 ul ONPG（溶于Z buffer中）至各反应管和空白管中，开始计时。 15) 将各管放入30℃水浴中。 16) 待出现黄色后，加0.4 ml 的1 M Na2CO3至各反应管和空白管中，以分钟计算消退时间。 注意：
? 需要的时间可能会变化，（对于单个的β-gal阳性对照质粒约需3～15min，对于双
杂交阳性对照约30min，弱的反应可能需24h.）
? 黄色不稳定，并且随时间延长可能加剧。每一批需要做一个新的空白管。 17) 14,000 rpm离心10 min，以除去细胞碎片。 18) 仔细小心转移上清到清洁比色杯中。
注意：如果上清中若混有细胞碎片，将严重干扰本实验的精确性
19) 以空白管在A420校准分光光度计，并且测量在OD420值。OD420值终在0.02-1.0之间才
会处于线性范围内。
20) 计算β-半乳糖苷酶单位，1个单位的β-半乳糖苷酶被定义为每个细胞每分钟水解
1umol ONPG为邻硝基苯酚和D-半乳糖所需要的量。 β-半乳糖苷酶活性单位 = 1000×OD420（t × V ×OD600） t = 孵育过程中黄色消退的时间（min） V = 0.1ml×浓度因子
OD600值 = 1 ml培养基的OD600值 注意：这里的终浓度因子是5（第七步），然而可以试用几个不同的稀释度以确保分析位于线性范围内。
? 为了减少实验的变异性，需挑5个单独的克隆，每个克隆进行3次试验。
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