2014-2015年江西省部分地区猪瘟分子流行病学调查

2014-2015年江西省部分地区猪瘟分子流行病学调查

高洋根，陈松昌，张文波，戴益民，杨丹凤，周荷田，邓舜洲*

摘要：猪瘟是严重危害我国生猪养殖的病毒性传染病。为了了解江西省生猪养

殖场猪瘟流行的情况，本试验收集2014-2015年江西省部分地区不同规模养猪场的猪样品进行猪瘟病毒E2基因的RT-PCR检测，并对E2基因测序和序列分析。结果表明，江西省部分地区的猪场仍然存在猪瘟的感染，收集的26株猪瘟病毒流行毒株都属于2.1基因型，其中22株属于2.1d基因亚型，4株属于2.1b基因亚型。推测目前江西省主要流行的猪瘟毒株为2.1d基因亚型。

关键词：猪瘟；E2基因，基因型

Molecular epidemiological investigation of classical swine fever in

partial areas of Jiangi province from 2014 to 2015

Abstract: Classical swine fever is viral diseases seriously harmed pig farming of China.In order to understand epidemiology of classical swine fever of pig farming of partial areas of Jiangxi province, swine samples were collected from different scale pig farms of partial areas of Jiangi province and detected E2 gene of classical swine fever virus,also E2 gene were sequencinged and analysed.Results showed that pig farm from partial areas of Jiangxi province still suffer from classical swine fever, all of 26 field isolated belong to 2.1 genetype, in which 22 belong to 2.1d subtypes and 4 belong 2.1b subtypes.It was suggested that the predominant genetype of classical swine fever virus strain was 2.1d.

Key words: Classical swine fever; E2 gene; genetype

猪瘟(Classic Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒 (Classic Swine Fever virus， CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染疾病，是严重危害我国和世界养猪业的主要病毒性传染病之一，猪瘟被世界动物卫生组织（Office International Des

Epizooties，OIE）列为A类16种法定传染病之一，在我国农业部公布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中也将其列为一类传染病[1]。

我国研制了猪瘟兔化弱毒疫苗，免疫保护效果较好，且对猪瘟均有严格法定防控措施，但我国依然未将本病彻底扑灭[2]。虽然较好的控制了猪瘟的大规模流行，但在部分地区，猪瘟仍有散发，并且其流行与发病特点发生了很大的变化，以温和型猪瘟、母猪繁殖障碍型猪瘟以及新生仔猪发病、死亡为主[3]。妊娠母猪感染低毒力毒株后，可成为病毒的携带者，这种母猪垂直传播率高，病毒突破胎盘屏障感染胎儿，影响胎儿的发育，产木乃伊胎或死胎，外观健康的仔猪能长期带毒并不断排毒，造成其他易感猪的感染，形成隐性感染和持续感染[4]，给猪瘟的防控加大难度。

基金项目：江西省生猪产业技术体系（ JXARS-03 ）

作者简介：高洋根（1990-）男，江西宜春人，研究生，主要研究兽医微生物及传染病。 *通信作者：E-mail shzhdeng163.com

本实验采集了江西省宜春、南昌、九江和上饶等规模化猪场疑似猪瘟的样品，扩增猪瘟病毒的E2基因并测序及序列分析，了解江西省猪瘟病毒E2基因的流行和变异情况，为科学合理的防控猪瘟打下基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 病料

实验样品来自江西省部分地区规模化养猪场，有病死仔猪、保育猪和育肥猪等，采集病死猪的淋巴结、脾脏、肺脏及唾液。

1.1.2 试剂

RNA提取试剂为大连宝生物公司产品，反转录试剂盒PromegaTrans Taq高保真酶、PCR相关试剂为北京全氏金生物科技有限公司产品，DNA Marker为北京天根生物科技有限公司产品，PCR产物纯化试剂盒为北京天根生物科技有限公司产品。 1.1.3 引物

根据GeneBank登录号为FJ529205的Zj-0801毒株的序列为参考序列，设计一对扩增猪瘟病毒E2基因的引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 扩增猪瘟病毒E2基因的引物 Table 1 Primer used for amplifing CSFV E2 gene

引物名称

E2-F E2-R

引物序列

5’-CGGCTGTCCTGTAAGGAAGACT-3’ 5’-ACCGGCAGCAAGTTGCTCTGT-3’

1119 bp

2440-3558

扩增片段大小

扩增位置

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取

取疑似猪瘟的病死猪淋巴结、脾组织至无菌匀浆器中，加入400 μL生理盐水研磨，将研磨液转移至1.5 mL无菌离心管中，4℃ 12000 r/min离心10 min；取200 μL上清，加入1 mL Trizol，剧烈震荡30 s，静置3 min；加入200 μL氯仿剧烈震荡30 s，静置3 min，4℃ 12000 r/min离心10 min；取600 μL上清液转移到新的无菌离心管中，加入等量的异丙醇，4℃静置20 min，4℃ 12000 r/min离心10 min；弃上清，加入600 μL 70%含DEPC处理水的乙醇，轻轻混匀，4℃ 12000 r/min离心10min；弃上清，加入30 μL DEPC处理的水溶解，用于反转录。 1.2.2 反转录

反转录第一步为预变性，RNA2 μL、Romdon Primer1 μL 、Oligo （dT）

15 1 μL和Nucleotide Free Water1 μL，70℃反应5min，冰上放置5min，加入5×Reaction Buffer4 μL、MgCl24.5 μL、PCR Nucleotide1 μL、RNAsin0.5 μL、Reverse Transcriptase1 μL、ddH2O4 μL到第一步的产物中。25℃反应5 min，42℃ 1 h，70℃灭活15 min，用于下一步的PCR反应。 1.2.3 PCR

PCR 50 μL体系为：10×Trans Taq Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物各0.5 μL、反转录产物2 μL、Trans Taq高保真酶0.5 μL和ddH2O37.5 μL。反应条件：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸1 min，共32个循环

最后72℃ 10 min。 1.2.4 产物纯化

按照天根PCR产物纯化说明书操作。 1.2.5 测序及序列分析

纯化的产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。使用MEGA5.0和DNAStar SeqMan对序列拼接。将拼接好的序列与GenBank上收录的参考分型的猪瘟病毒E2蛋白基因对比，用DNAStar MegAlign软件用Jotum Hein Method比对，从序列的核苷酸同源性和系统进化树来对序列进行分析。

2.结果

2.1 E2基因的RT-PCR

RT-PCR产物与Loading Buffer混合后，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。110 V 70 mA电泳20 min后在凝胶成像系统观察电泳结果如图2-1。由图可知，JX-YC01和JX-YC02毒株能扩增到约1119 bp的单一条带，与预期大小相近。

图1 RT-PCR扩增猪瘟病毒E2基因的琼脂糖凝胶电泳图 M：Marker 2000；1：JX-YC01猪瘟毒株；2：JX-YC02猪瘟毒株

Fig1 Agarose gel electrophoresis for amplifing E2 gene use RT-PCR M：Marker 2000；1：JX-YC01 CSFV Strain；2：JX-YC02 CSFV Strain

2.2 序列分析

将26个猪瘟E2基因的测序结果拼接，命名为JX-YC01、JX-YC02等，使用DNAStar MegAlign构建的系统进化树如图2-4所示，参考毒株Taiwan2007与其他毒株的核苷酸替换最多，属于3.4基因型。Vaccine为中国的疫苗毒株C strain，与Shimen毒株和Alfort同源关系更近，属于1.1基因型。本实验收集的毒株除了有22个与2.1d基因亚型的参考毒株处于同一分支，分别用黑色三角形标记，3个与2.1b基因亚型的参考毒株处于同一分支，分别用白色三角形标记，另一个毒株处于2.1a与2.1b基因型之间，将CSFV-JXYC02划分为2.1b，如图2-4中在系统进化树中用正方形所标记的。

图2 系统进化树分析 Fig 2 Analysis of phylogenetic tree

3.讨论

上世纪九十年代后，我国流行的猪瘟毒株主导地位的是2.1b亚型。目前，我国对猪瘟的防控措施主要采取强制免疫猪瘟兔化弱毒疫苗，C株属于1.1基因型，但其疫苗免疫原性好，对我国2.1b 基因亚型毒株也具有良好的交叉保护效

果。在亚洲一些国家和地区包括中国、日本、韩国和台湾地区的猪瘟病毒流行毒株，由于猪瘟疫苗的选择压力等因素发生了转变[5]。

本实验收集了江西省内的猪瘟阳性样品，通过RT-PCR扩增猪瘟病毒全长E2基因序列，并测序分析，构建系统进化树。江西省流行的毒株主要是2.1基因型，其中2.1b基因亚型占收集毒株的15.3%，2.1d基因亚型占所有收集毒株的84.7%，为主要的流行毒株，与2015年冯丽苹等[6]和2015年Zhang Hongliang等[7]

报道我国目前流行2.1d基因亚型毒株相吻合。其中收集的猪瘟毒株样品中，以宜春地区和南昌地区的猪瘟流行毒株最多，这些地区可能是猪瘟野毒株感染较严重的地区。

值得注意的是，Shimen强毒株属于1.1基因型，HCLV也属于1.1基因型， 本研究收集的猪瘟样品中，未发现1.1基因型的毒株，可能与广泛的使用HCLV疫苗，有效的控制了1.1基因型的毒株流行有关[8]。

参考文献

[1] 张彦明. 兽医公共卫生学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2011.

[2] 栾培贤, 肖建华, 赵靓, 等. 猪瘟国内外流行情况概述[J]. 东北农业大学学报,

2013(09):155-160.

[3] 傅彩霞, 郑瑞峰, 郭峰, 等. 北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析[J]. 动物医学进

展, 2012(01):61-66.

[4] 王春花, 孙元, 仇华吉. 新型猪瘟疫苗研究进展: 动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类

健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会, 中国江苏徐州, 2013[C].

[5] 彭志成. 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查[D]. 山东农业大学, 2013.

[6] 冯丽苹, 张洪亮, 刘春晓, 等. 2015年我国部分地区2.1d新基因亚型猪瘟病毒的分子流行病

学分析[J]. 中国预防兽医学报, 2015(09):651-655.

[7] Zhang H, Leng C, Feng L, et al. A new subgenotype 2.1d isolates of classical swine fever virus in

China, 2014[J]. Infect Genet Evol, 2015,34:94-105.

[8] 王博扬, 邵卫星, 吕占军, 等. 2012年我国部分地区猪瘟流行病学调查及E2部分基因遗传演

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