基因测序案例

? 高可信度Small RNA及其前提Small RNA序列筛选（使用转录组组装结果中的non

protein-coding序列代替基因组数据，进行miRNA前提序列的提取，再展开分析）；

（2）Repbase等数据库（至少2个数据库）比对（一系列non-coding RNA分析）：选取

Repbase数据库来注释测序得到的小RNA序列，尽可能的发现并归类其中可能的repeat associate sRNA，并分别对测序数据（总数）以及Unique数据（种数）进行统计，区分出6个时间点中均有表达的共有序列、特异性表达的特有序列分析，提供分析数据及展示图。【4龄期L1 6龄期L2 蛹期L3 1年

成虫L4 2年成虫L5 4年成虫L6 六个时间段分别统计】。具体内容如下： ? U 数据 miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）的组成，提供分析数据及展示图；

? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA组成分析，时序变化规律；

? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点共有序列及特有序列分析； ? 各发育节点差异序列表达趋势分析miRNA-STC，差异筛选； ? Small RNA 表达水平差异方差分析；

? 筛选高可信度miRNA及其前体miRNA序列，及高可信度miRNA及其前体miRNA序列在6个发育阶段的分布(使用转录组组装结果中的non protein-coding序列代替基因组

数据，进行miRNA前提序列的提取，再展开分析。或自有软件)

4．用Rfam、GenBank、starBase、CleaveLand等数据库，进行降解片段鉴定、及其差异分析

1）数据 U 的重复序列、降解片段鉴定分析，提供分析数据及展示图（希望尽最大努力） （1）数据 U Small RNA重复序列、降解片段鉴定

（2）数据 U 重复序列、降解片段在miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，

miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）当中的比率分析。

2）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点的重复序列、降解片段鉴定分析，提供分析数据及展示图（希望尽最大努力）

（1）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点的Small RNA重复序列、降解片段鉴定 （2）在Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点少年上，miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，

snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）重复序列、降解片段鉴定的比率分析；

5．新miRNA预测（利用Mireap 或mirdeep等数据库，对未注释的small RNA 进行预测，预测新Small RNA（对于

未知的small RNA，不要局限于模式生物，要利用所有的small RNA数据库结合mRNA数据，界定未知的small RNA。

或使用转录组组装结果中的non protein-coding序列部分代替基因组数据，进行新miRNA预测）。

20

或对18个样本数据粉笔记性整理归纳以及数据归一化处理，筛选高置信度的miRNA。鉴定测序得到的miRNA分别属于哪一类。NEW(针对已知并报道的前体序列中新发现的miRNA序列)；Diff(本次实验中测序获得的序列与miRbase报道的序列碱基组成具有一定差异性，极有可能在测序的物种的特定阶段中，另一种miRNA异构体高表达)；YES(代表了测序获得序列与miRBASE报道中完全一致)。有公司说用CGT101软件进行预测

除常规程序性分析外，提供以下分析数据及展示图：

1）基于比对位置及周边碱基序列预测茎环结构形成能力分析（二级结构预测）

2）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点新Small RNA预测结果，提供分析数据及展示图

（1）各发育节点分别预测出的新small RNA数量、及类型； （2）绘制新的Small RNA 的二级结构图，进行进化分析； （3）新small RNA基因的靶基因预测 6．靶基因预测、GO功能分类、聚类分析

http://wenku.http://www.china-audit.com//view/0960233987c24028915fc3ec.html→应特别关注其分析方法和数据库。选用TargetScan、miRanda、PicTar、miRDeep、

Tarbase、miRecords、miRbase、Mireap、PITA、MicroCosm、miRTarBase、miRGatorv2.0、MiRNAMap、miRDB、RNAhybrid、miRGen——中最适合的等数据库和预测工具，进行分析。

包括已知和预测出的Small RNA。除常规程序性分析外，提供以下分析数据及展示图： 1）预测分析，提供分析数据及展示图

（1）在U 数据全部基因中：能够预测出靶基因的基因数、未能预测出靶基因的基因数，

提供数量及展示图

? 数据 U 的靶基因预测

? 差异Small RNA 与靶基因调控网络。

（2）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点的全部基因：能够预测出靶基因的基因数、

未能预测出靶基因的基因数，提供数量及展示图； ? 各发育节点Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6的靶基因预测 ? 差异Small RNA 与靶基因调控网络。

2）靶基因 GO 功能分类、表达模式，提供分析数据及展示图 （1）数据 U 的GO 功能分类

（2）各节点Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6的GO功能分类

（3）Small RNA （包括已知和预测出的Small RNA）的表达模式

? 基于TPM等方法计算，各发育阶段Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6 表达量模式；───────────────→ ? Y 1-U、Y 2-U、Y 3-U、Y 4-U、Y 5-U、Y 6-U 表达量间的差异分析；─────────────────→ ? Y 1-U、Y 2-U、Y 3-U、Y 4-U、Y 5-U、Y 6-U表达量差异的强度分析 ↓

21

3）表达模式聚类分析（是否进行或不进行时间纬度的层次聚类？） （1）总体聚类，提供分析数据及展示图

? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6及 U 的7样的差异miRNA双向层次聚类，7张图；

? 分析所聚类间的差异；

（2）分类聚类，提供分析数据及展示图

? 按照miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，

siRNA暂不做）类型，分别进行各发育阶段Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6差异Small

RNA的双向层次聚类；

（3）靶基因功能通路富集分析，提供分析数据及展示图 4）KEGG Pathway注释、分类、表达模式，提供分析数据及展示图

（1）Cellular component，Molecular function，Biological process的3个注释 （2）KEGG Pathway注释、分类、表达模式 (按照mRNA的分析要求进行，不重复描述) （3）差异表达miRNAs靶基因和RNA-Seq中DEGs关联基因的KEGG Pathway注释

7．已知miRNA （包括已知和预测出的miRNA）的家族分析

将新预测的miRNA在基因组上定位，并寻找可能同时转录的miRNA。采用间距分别为3kb，5kb,10kb，50kb来进行cluster聚类分析。已知Small RNA包括注释的注释出的和预测出的；除常规程序性分析外，提供以下分析数据及展示图：

22

1）miRNA成簇分析，cluster水平上miRNA的差异表达分析

2）分别比较花绒寄甲miRNA 家族，与已知miRNA赤拟谷盗Tribolium castaneum、家蚕Bombyx

mori家族的差异（或黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、意大利蜜蜂

Apis mellifera、埃及伊蚊Aedes aegypti等，但必须与“2. 转录组组装与分析” 所选定的种类保持一致），

提供图和数据；

3）长寿基因、线粒体基因簇分析(序列的获得→基因定位→系统进化→靶基因的预测→靶基因的功能。参

考基因组选择必须与“2. 转录组组装与分析”所选定的种类保持一致：赤拟谷盗、或家蚕)。提供图和数据(做图文献：miRNA-9基因家族进化分析及其靶基因预测 http://www.cjcb.org/news/upload/20110511-9.pdf）

8．miRNA前体（发夹结构）二级结构预测 （尽量做，并追求高精度）

参照“黄杨潮 miRNA 前体与成熟体预测方法的设计与实现 哈尔滨工业大学2011 年 6 月”、“翁露晖 用生物信息学方法预测水稻新的miRNA前体及其成熟miRNA 中山大学 2010年6月”等等方法。 利用数据库miRBase、miRNAMap、miRGe、TIGR、Rfam、Refseq、EST，等等。选用软件vMir、Linux、Blastn、RNAfold、MiRService、Soap、MiRscan、miRseeker、ProMiR II、ERPN、SVM 等。有公司说用CGT101软件进行预测 特别提醒：先做前体分析（否则后边的成熟体可能找不到或预测不出来）→再做成熟体→基因组分布→染色体分布 1）pre-miRNA预测，提供分析数据及展示图

（1）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点的pre-miRNA预测； （2）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6相互间预测结果差异分析； （3）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各自预测出的miRNA前体特征

? 长度分布；

? 环茎结构（数量、环长度）、自由能（折叠、最小）、GC含量； ? pre-miRNA靶基因预测

2）miRNA 成熟体鉴定(预测)，提供分析数据及展示图

（1）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各自的成熟体鉴定(预测),提供鉴定结果数据库； （2）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6相互鉴定结果的差异分析(列出很简单的表格)； （3）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6所鉴定出的miRNA成熟体靶基因预测，提供数据。 3）预测出的pre-miRNA及成熟体与mRNA的联合分析，提供分析数据及展示图 （1）预测出的pre-miRNA与mRNA联合分析，确定关联的mRNA； （2）鉴定出的成熟体与mRNA联合分析，确定关联的mRNA；

9．指定分析（注：包括已知的miRNA和预测出的新的miRNA）（提供指定基因保守片段、简并引物、

或基因片段信息，见附件。下同）

1）长寿基因与Small RNA 的重复序列的比对信息，提供分析数据及展示图

? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6、U 各自的长寿基因数量变化分析 ? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6、U 各自的长寿基因重复序列变化比较 ? 特异性长寿基因筛选及功能注释

2）长寿基因与Small RNA 与 exon/intron 的比对信息分析（还有可能开发出一个分析程序来）

利用花绒寄甲的T、X1、X2、X3、X4、X5、X6拼接组装数据，及Small RNA 的Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6、U 数据，分析“可变剪切基因数、CDS内含子基因数、UTR内含子基因数、无内含子基因数、

23

●

●

●

●

●

●

●