慢病毒制备

慢病毒制备

细胞转染

A）在转染前一天，用胰蛋白酶消化HEK-293T细胞，以含有10%血清的DMEM培养基调整细胞密度为50%-60%，接种到100mm细胞培养皿。 （培养皿提前用polylysine treat 10min，PBS wash 3 times）。

置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80%-90%既可用于转染。

B）配置DNA混合液：将7.5 ug PAX2 、2.5 ug pMD2和10ug 目的DNA溶于2.5ml Opti-MEM I Reduced Serum Medium 中，用移液器混合均匀。

C）配置脂质体溶液：将60ul lipofenctamine 2000 溶于2.5ml Opi-MEM I Reduced Serum Medum中，用移液器混合均匀,室温下静置5分钟。

D）将上述两种溶液混合，并轻轻混合均匀，室温孵育25分钟。 E）将5ml混合液加入到10cm培养皿，混合均匀。

F）将细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养12-16小时。

G）把细胞传出来到15cm 培养皿，加15ml DMEM, 37℃培养 48-72小时。

H）收集细胞上清液，4℃，1000 rpm 离心5分钟，除去细胞碎片。收集上清即为含病毒颗粒的培养基（可用0.45um过滤器过滤一下），分装，-80℃保存。

慢病毒感染靶细胞

A) 感染前一天，将成纤维细胞接种到6孔板中，保证感染时细胞密度达到80%.

B) 将病毒液和新鲜培养基按照1:1（1ml+1ml）的比例配制，并加入促传染剂Polybrene（8ug/ml）。

C) 吸取培养皿中的培养基，加入配制的含病毒的培养基，混合均匀后置于37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。

D) 24小时传到10cm的大皿，将含有病毒的培养基换成正常培养基，继续培养一天。 E) 用含有5ug/ml 嘌呤霉素对细胞进行为期5天的筛选。

注意！接触到病毒的细胞管子要用84浸泡至少12个小时。