一些哺乳动物细胞中所有的Atg5蛋白和Atg12蛋白均以共价结合的形式存在并且表达水平不变，至少是在短期饥饿处理时不变。因而，监测共价结合的Atg12-Atg5来反映自噬的诱导在本质上可能是一个无效的方法。然而值得注意的是，在某些细胞系中检测到了游离的Atg5，意味着Atg5的含量可能依赖于细胞系本身。另外一个可能值得考虑的变量是共价结合的Atg12-Atg5的含量可能会由于长时间处于饥饿状态而增加，这一现象由肝细胞和成纤维细胞中观察得到。
最后，我想指出一个普遍存在的问题，即在检测过程中可能引入多种的压力，例如：由于细胞溶解而产生的机械压力，加热或冷却样品产生的温度压力，显微镜滑动产生的氧化压力，这些都可能引起一些认为变化。提出这一点不是为了有意限制使用任何特殊的方法，而是为了指出没有完美的检测方法。因而，证实在检测过程中正向调控（雷帕霉素处理）和负向调控（抑制剂处理）的方法按照预期的想法进行十分重要。
3.荧光显微镜 LC3B（从本文的此处后用LC3代替），或者N端标记了荧光蛋白（如GFP, GFP-LC3）的蛋白质，已经被应用于间接免疫荧光或直接荧光显微镜的方法监测自噬，衡量的方法是测定LC3或GFP-LC3亮点的增加量。GFP-LC3/Atg8的检测在用转基因生物，如：线虫、粘菌、果蝇、拟南芥和鼠中进行的体内研究也十分有用。也可以在免疫细胞化学或免疫组织化学的实验中使用抗LC3的抗体，具有检测内源性蛋白，省却转染和转基因的程序的优点，以及避免可能因过度表达而引起的潜在人工因素。检测内源性蛋白显然依赖于在感兴趣的系统中检测的能力。如果内源性蛋白的含量达不到检测的水平，那么必须确保使用内源性蛋白质的构建。在这种情况下，考虑使用比瞬时转染稳定的转化十分重要。稳定的转化因为蛋白表达低所以可以减少背景，同时也具有消除暴露于转染试剂的优点。更进一步说，利用转化更多的细胞可以便宜的分析，因为几乎100%的细胞将会表达被标记的LC3。另一方面，稳定的转染子有一个缺点，即整合位点不能完全被预测，表达水平也不是很合适。更进一步说，瞬时转染具有检测被转染蛋白对自噬的即时效应的优点。另外，用双重转染（用GFP-LC3和感兴趣的蛋白）来直观的标记可以表达待检测蛋白的细胞，这种方法可能和稳定的转化子间存在更多地问题。总之，在使用稳定转染和瞬时转染之间没有适用的简单规则。当使用稳定转染时，筛选具有最佳信噪比的克隆是值得的，在使用瞬时转染时，优化GFP-LC3 DNA的浓度以获得最佳的信噪比是值得的。优化和适宜的控制，有助于克服检测中的内在易变性效应。
GFP-LC3的另外一个作用是在与自噬相关联的过程中，如细胞器的降解和病原微生物的隔离，监测其与目标分子的共定位。在线虫中观测自噬时，最好选用GFP-LC3 (GFP:LGG-1；图四)的整合变体而不是染色体外构建，因为后者在不同的动物中的表达水平易变。另外，使用整合变体后仍可以利用western印迹的方法分析脂化。最后，我们指出基于GFP的显微镜的纳米分辨能力的提高，将进一步加强这项技术所带来的价值和可能性的可用性增加。
在巨自噬（细胞质的非特异性隔离）和自噬相关过程（如：细胞质到液泡的标记途径，细胞器特异性降解和自噬清除入侵的微生物）均需要酵母Atg18的参与。近期的一项研究表明当自噬被诱导时，人类中与Atg18同源的物质（WIPI-1)在LC3阳性的膜结构处积累，同时Atg18含量的增加与LC3-II含量的增加相关。Atg18的内源性含量也可以通过间接的荧光显微镜和免疫电镜的方法检测，转染后GFP-Atg18的存在位置相似。因此，在检测中Atg18含量和分布可以替代LC3。至于其它的Atg蛋白，Atg9也显示出与GFP-LC3部分共定位的特性。监测Atg9的定位还没有广泛的应用于高等真核生物中，但是和在酵母中观察到的现象一样，这种蛋白在Atg1/Ulk1踏车中表现相同的类型依赖性，这表明这种蛋白质可以作为Atg1功能的指示标志。最后，Atg8/LC3是在高等真核生物中与自噬体保持相关的唯一的蛋白，其余的蛋白，特别是Atg5, Atg12和Atg16，通过荧光和免疫荧光检测显示其与吞噬泡相关。
注意 虽然GFP-LC3的荧光分析是一个很实用的方法,但是通过测量GFP-LC3(或LC3免疫)的方法定量分析自噬比用western印迹的方法测定LC3-II更加繁琐。最理想的情况是包括
检测和两组结果的比较。另外，如果GFP-LC3已经被定量了，那么最好检测每个细胞中反映GFP-LC3的亮点数量，而不是简单的记录所有细胞中显示的亮点总数。后一点十分关键，因为即使是在营养丰富的条件下仍会显示一些基本含量的GFP-LC3亮点，除非那些细胞缺少自噬相关基因（即使缺失相关基因，在特殊的条件下仍有可能得到GFP-LC3的亮点）（图3B）。这里还存在人工的和可靠的亮点计数的实际问题，特别是当每个细胞中的数量都较大时（这可能比依赖于程序软件的计数更加准确，因为确定只有适宜的亮点才被计数十分重要）。同时，当自噬体-溶酶体的融合被阻断时，较大的自噬体能够检测得到，这可能是自噬体-自噬体融合的结果。在许多细胞类型中，也许可以为每个细胞中的亮点数建立一个截至值，来区分低自噬和高自噬。这可以通过使细胞接触自噬诱导剂和阻断剂的实验检验。因此，细胞群体中含有自噬体的细胞比例比扰动条件下的截至数目占对照组细胞数目的比例更大，这一点可以提供自噬改变的定量证据。然后就可以根据细胞数和百分比来显示自噬体数目。这种方法在背景的亮点数目很低时是唯一可行的方法，并且在这种条件下，对大量细胞的计数尤为重要（根据不同的系统和实验，可能要求50或更多的细胞，最好至少复查三次）。
为了让其他试图重复这些实验的研究人员进行比较，作者指定亮点基线用来定义“正常”或“低”自噬十分关键。此外，应该采用无偏程序（在包含所有细胞的一定间隔处使用随机起点）进行细胞计数，由于检测结果是高度变化的，所以基线和环境改变的信息必须进行统计。一个在大量细胞中进行无偏GFP-LC3亮点计数的可能方法是多光谱成像流式细胞仪。这种方法通过形态和免疫荧光图案相结合的方法允许描述群体内的单个细胞的特性，从而提供统计上有意义的数据。另外一个需要引起注意的地方是在使用荧光显微镜时确定大小是成问题的，除非仔细的提出一套标准化规定。更进一步说，不同大小的GFP-LC3亮点与自噬水平的关系还不是很清楚。
一种可能确定亮点背景水平的控制方法是检测未加GFP（绿色荧光蛋白）标记的荧光强度。在使用GFP-LC3时一点特别的需要注意的是，这种嵌合体可以与聚合关联在一起，尤其是在高水平易聚合蛋白存在的情况下，这可能会导致对结果的误解。值得注意的是，GFP-LC3可以与泛素蛋白聚合体相关联；然而，当GFP-LC3表达水平很低时这一现象不会发生。这些聚合体在其他系统中也有被描述，经常被称为聚合样诱导结构或ALIS，树突细胞ALIS，p62 bodies/sequestosomes和包裹体。在体内和体外抑制自噬的活性导致这些聚合体的积累，暗示着自噬介导聚合体的清除。在体外，泛素蛋白聚合体的形成需要接头蛋白p62。在这种情况下，p62蛋白与泛素蛋白和LC3之间的相互作用被认为能够介导聚合体向自噬系统的传导。许多细胞内压力可以诱导聚合体的形成，包括转染试剂。例如：MEFs的脂质体转染，COS7的磷酸钙转染，神经元细胞基本水平很高的GFP-LC3亮点水平和LC3-II含量的提高。在这里考虑一件十分有趣的事情，在许多转染过程中用到的氯喹可以刺激自噬体的形成，但是它会抑制整个自噬过程；许多转染试剂是通过细胞的内吞作用发挥作用的，一些基于脂质和聚乙烯亚胺的试剂处在防止溶酶体酸化的缓冲液中时效力更强。一种解决方法是在稳定表达GFP-LC3的细胞中检测GFP-LC3的亮点数量；由于GFP-LC3和LC3-II含量的增加往往是瞬时的，所以另外一种方法是用GFP转染的细胞，这些细胞受到模拟时间匹配的转染作为背景对照物（负调控）。一个脂化缺陷LC3的突变体，其中第120位甘氨酸突变为丙氨酸，针对这些不依赖于自噬（可能通过其与P62的相互作用，见上文）的聚集体，并导致这种突变可以作为另外一个有价值的对照物。
泛素蛋白聚合体的形成和消失代表了一个细胞循环的过程。当自噬过程被抑制或者当传导到聚合体的蛋白形成能力超过自噬的降解能力时，聚合体开始形成。原则上讲GFP-LC3阳性聚合体的形成是自噬过程的一部分。然而，泛素化的GFP-LC3阳性蛋白的形成不能够直接反映自噬的诱导（或者自噬体的形成），或者是流经这个系统。实际上，泛素化蛋白聚合体可以在自噬缺陷的细胞内产生。因此我们应该记住，GFP-LC3亮点可能代表在细胞质中一
个混合的泛素化蛋白聚合体，自噬体和其他传统意义上的吞噬泡和自噬体中的泛素化蛋白聚合体承载着细胞质中的其它底物。再者，最近的一项研究表明，用皂素和其它类的洗涤剂处理可人工的刺激GFP-LC3亮点的形成。在肝细胞和稳定转染GFP-LC3的HEK-293细胞中没有检测到GFP-LC3的情况下，皂素处理的方法已经被用于降低荧光背景；然而，根据这些发现的结果，在这类实验中需要添加对照实验。一般说来，最好包含一些额外的测量自噬的检测方法，而不仅仅是依靠监测GFP-LC3。此外，我们建议研究人员在一开始就通过证实在用药理学或基于RNA干扰的自噬抑制剂处理过的细胞内不存在GFP-LC3亮点来验证他们的检测方法是否正确。例如，3-甲基腺嘌呤(3-MA)广泛应用于抑制饥饿或雷帕霉素诱导的自噬过程。
另外一个普遍存在的局限性是GFP-LC3的检测需要适合转染或转基因（如感染）的系统。因而在一个基本的的非转基因细胞内使用GFP-LC3具有很大的挑战性。再次强调，必须包含有证实转染过程本身不会人工诱导产生GFP-LC3亮点或导致LC3聚合的对照物。更进一步说，转染的构建程度要较低，转染的细胞要经过一下检测（1）什么时候达到适合检测的表达水平，（2）在检测的时限里，基础的GFP-LC3亮点保持适当的低水平。此外，在自噬被抑制的条件下证明被诱导的GFP-LC3亮点含量在数量上有所减少十分有用。对于一些基本的细胞，通过重组慢病毒、腺病毒或者逆转录病毒的感染方法将GFP-LC3运送到前体细胞中，随后分化成为感兴趣的细胞类型，是已分化细胞类型转染的有力替代者。
另外一个需要考虑的是，转染过程或者病毒感染过程，激活某些细胞中的压力途径，并可能诱导自噬的产生，再次强调了适当的对照物的重要性，如表达GFP的对照病毒。当提到转染时，改变依赖于背景环境的过程是必须的（详见关于氯喹的注意事项）。此外，改变培养基的成分然后在转染后等待24到48小时有助于减少转染试剂引起的GFP-LC3亮点的背景水平。当在瞬时转染中使用mCherry-GFP-p62双标签时（详见下文中的Tandem RFP-GFP荧光显微镜），在转染后最好等待48小时以减少聚合体的形成和潜在的自噬抑制效应。
最后，尽管LC3-II主要是与膜相连的，但是这并不意味着像想象中的那样与自噬体相连；这种蛋白经常在自噬体的前体吞噬泡上找到。此外，LC3连接到PE的位点还没有找到，即使在不能形成自噬体的自噬突变体中Atg8—PE/LC3-II的水平也可以增加。一种可以用来检测LC3-II与膜结合的方法是在Triton X-114中进行差异性提取，这可以应用于哺乳动物细胞中。另外一种方法是检测LC3与Atg5的共定位（或者其它Atg蛋白）；Atg12—Atg5结合体不能与自噬体保持关联，所以共定位结构可能对应于吞噬泡。重要的是，我们再次强调GFP-LC3亮点的数量和LC3-II含量的稳态相似，仅仅反映自噬相关结构（如自噬体）某一瞬间的数量，而不是自噬通量。
至于说Atg18或者GFP-Atg18的检测，至今仍未证明Atg18亮点是否能在人类细胞之外的系统中检测出来，而且亮点形成的数量依赖于细胞所处的环境。另外，Atg18还没有在完整的（成熟的）自噬体中检测到，所以Atg18可能只装点吞噬泡。此外，Atg18亮点的形成可能只对监测自噬有用，对自噬通量没有帮助。
4. TOR和Atg1激酶活性 TOR复合物I (TORC1)在蛋白激酶B的下游以一种不依赖于转录的方式负向调控自噬过程。在大多数系统下，TOR的抑制将导致自噬被诱导。TORC1的活性可以通过其靶蛋白的磷酸化程度和下游效应，如p70S6激酶或者S6蛋白，而检测出来。对p70S6激酶而言，检测TOR的直接作用位点并且雷帕霉素敏感的389位苏氨酸的磷酸化程度十分重要；C末端磷酸化位点并不总是与TOR的活化作用相关。因此，在体外定量分析p70S6激酶的活性比较好，但是这需要更多的努力。TORC1活性的下降可以导致自噬的诱导，然而这并不是直接的衡量方法。相反，在体外当自噬被诱导时，Atg1对外源性底物的激酶活性上升。在酵母中和其它可能的生物中，有可能利用检测Atg1激酶活性的方法来验证自噬被诱导。
注意 还有一些不依赖于TOR的机制诱导自噬过程。因此，证实待分析的途径依赖于TOR的抑制十分必要。目前，由于真正的底物还没有被描述所以把Atg1激酶活性当作工具来
检测自噬受到很大限制；现在的检测方法依赖于人工底物髓磷脂碱性蛋白的体外磷酸化修饰。如果能够鉴定出一个Atg1的生理底物，就可能像分析TOR一样在体内追踪它的磷酸化。
5. 转录调控 自噬的诱导在一定情况下伴随着某些自噬基因mRNA水平的增加，如Atg8/LC389和Atg12基因。因此，利用northern印迹或qRT-PCR的方法检测LC3 mRNA的含量也许能过提供与诱导自噬有关的相关数据。这些改变是否足以诱导自噬还不是很清楚，因而这并不是直接的检测方法。值得注意的是，Atg2, Atg4, Atg5 和Atg7等Atg基因转录水平的巨大改变就发生在果蝇唾液腺细胞死亡之前（伴随着自噬水平的增加），而Atg8a和Atg8b没有明显的变化。然而，在幼虫发育的最后阶段伴随着自噬的诱导，在脂肪体内可观察到果蝇Atg8a和Atg8b基因的转录上调，果蝇l(2)mbn细胞在饥饿条件下表现出果蝇Atg8b基因转录水平的增加。
注意 当自噬被诱导时，大多数Atg基因的mRNA含量不会发生明显的改变。即使是LC3 mRNA的增加也是适度的，并且还依赖于细胞的类型和来源的生物。此外，最好是追踪蛋白质水平，因为蛋白质才是与自噬的起始和完成相关的最终有效因子，尽管Atg蛋白的含量不是大幅度的改变而且增加的程度依赖于细胞类型和组织来源。最后，自噬蛋白含量的改变并不是自噬诱导的充分证据，必须伴随着这里描述的其它检测方法才可以。
B 通过通量的方法监测自噬
自噬不仅仅包括Atg8/LC3的合成和脂化，以及自噬体的形成，更重要的是通量，或者说是整个系统中的流体，包括溶酶体和液泡。因此，自噬的底物需要被监测已确定它们到达过这个细胞器，并且在适当的时候降解。
1. 自噬性蛋白质的降解 蛋白质降解分析代表了一种测量自噬通量的行之有效的方法，并且能够很好的量化。一般的策略是用放射性的氨基酸（如[14C]-亮氨酸或 [14C]-缬氨酸）标记蛋白，最好是相对较长的一段时间，以达到代表自噬底物最好的长寿命蛋白质得到充分标记的目的，随后经过一个长的冷冻过程以确保检测开始时被标记的短寿命蛋白质已经被降解了。下一步，测量来自未受损的细胞中或被灌注的器官中标记蛋白的酸溶液的放射性依赖于时间的释放。然而测量的降解中的一部分与自噬无关，所以必须在3-MA或者是氨基酸抑制自噬的浓度下进行平行测量；然后从总测量值里减去这一部分。互补的办法是使用阻断其它降解途径的化合物，如蛋白酶抑制剂，由于不同降解系统间的干扰可能产生意想不到的结果。例如阻断蛋白酶功能可以刺激自噬。因此，在特殊细胞类型和背景中进行检测时，了解所使用的抑制剂是否会改变自噬十分关键。此外，在一些特定的条件下3-MA可能产生一些不依赖于自噬的效果，所以验证3-MA敏感的降解是否对一般的溶酶体抑制剂（如氯化铵）也敏感是明智的。
另外一个可以考虑的检测方法依赖于甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）融合蛋白的有限水解。先前的一项研究表明全长44kDa的BHMT在存在亮肽素的肝细胞溶酶体内被切割生成32kDa的片段。32kDa片段的积累依赖于时间并且可以通过用自噬抑制剂处理而阻断。这个标记分子的一个修饰形式，GST-BHMT，可以和野生型蛋白质的行为相似的在其它细胞系中表达。其它的底物可以考虑使用相似类型的检测方法。例如，新霉素磷酸转移酶II-GFP(NeoR-GFP)融合蛋白是自噬的靶标。将具有表达NeoR-GFP质粒的淋巴母细胞繁殖一段时间后在3-MA中继续繁殖，通过流式细胞仪检测发现这会引起NeoR-GFP蛋白的积累。
注意 检测长寿命蛋白质的降解需要预先放射性标记那些细胞（随后把酸溶液从放射性酸不溶性物质中分离出来），尽管这种标记在培养的细胞中很容易操作，但是这样的脉冲追踪实验不适用于动物中，虽然它们可以在灌流的器官中实现。在细胞中，也可以通过色谱的方法来检测未标记氨基酸的释放，因而免除了预标记的必要。在任何情况下，一个潜在的问题是被释放的氨基酸可能继续参与代谢。例如，支链氨基酸在肝细胞中是很好的水解指
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