高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南

体酶活性最高，但是最主要的成分还是线粒体），可以通过连续密度梯度离心的方法分散为自噬体，自噬泡和溶酶体。这些组分中的任何一部分都可以认为是组织组分的代表样品，可以用于自噬颗粒群体的定量生化研究，离心研究和形态学研究。获得的数据可以用精细的统计学分析进行进一步的分析。

自噬过程最简单的研究方法利用了隔离标记酶，这些酶位置的改变，颗粒/区室大小的不同和不同大小的颗粒对机械压力及渗透压力敏感度的不同（酸性水解酶常见于膜结合区室并且除非膜被裂解，否则它们的潜在活性不能够测量出来）。例如，自噬泡比末溶酶体/次级溶酶体大得多，通过渗透压冲击或机械损伤可以在自噬泡中检测到这些酶释放量的增加。这些酶含量变化的可检测性可以用于外源诱导的或自然发生的自噬过程的时间历程的追踪。

细胞质内特殊颗粒群体酶活性（或其它分子标记）和这些标记分子在自噬过程中位置的改变可以通过沉积型超高速离心机完成定量定位。把离心力应用于颗粒均匀分布的样品时，颗粒携带它们的标记分子一起以不同的迁移速率远离旋转轴。根据颗粒的大小和相对密度，标记分子在离旋转轴不同距离处分段分布。这些分布方式可以用于确认哪些标记分子存在于同一种颗粒中，标记分子转移到颗粒后是否会引起物理性质的改变。通过密度梯度离心可以获得相似的结果，颗粒被载入密度梯度中（有时用蔗糖，但是如下文注意事项里讨论的那样，最好选用iodixanol, metrizamide和Nycodenz），然后离心，直到它们到达与它们的密度相等的密度梯度所在的位置。

亚细胞组分中的颗粒群除了可以用生物化学和离心的方法定量分析外，也可以利用形态学定量分析的方法来研究。自噬过程中所涉及的粒子群详细的形态学研究通常需要使用电子显微镜。在完整的细胞中和亚细胞组分中，这类研究所需要的薄层切片是要面对的主要问题。在使用亚细胞组分时，每0.1ml的颗粒要分成2000000份，所以实际样品的大小对总样品大小而言是极其微小的。然而，通过均质化和再悬浮过程，亚细胞组分中的复合物和异源化合物可以在整个组分内随机分布。因此，如上文提到的那样，整体的任何等分小份可以被看作整体的一个随机样本。必要的是要保存在样品世代中亚细胞组分可以被电子显微镜检测的性质。这可以通过压力过滤过程在过滤器上沉积整体的等分小份中的内含物，然后覆盖上一层红血球细胞，为电镜下观察进行处理，嵌入和切片等操作。由于压力的方向垂直于过滤器的平面，所以包含完整颗粒厚度的任何部分都可以当作整体颗粒的随机样本。由于单个部分很薄，可能是某种颗粒的多个部分的聚合体，所以形态学/体视学的方法必须用于确定一个给定类的粒子所占用的体积，和该类颗粒的大小分布及平均体积。根据这些信息，一种特定类群的颗粒的数量可以计算出来。如果获得了自噬系统中所有类型颗粒的数据，颗粒间相互作用的动力学特征句可以进行评估了。单个剖面的检测提供了不同类型颗粒的含量，降解程度和是否附着在膜上的信息。把上文提到的生物化学和形态学定量分析的方法结合起来，显示出大多数特定的标记酶和细胞器群体具有相似的沉积特性，可以用来确认这些酶的位置。这也可能定量显示鼠肝中大多数末溶酶体/次级溶酶体的铁标签可以通过外源铁负荷而获得，铁粒子向自噬体的转移使得在同一个亚细胞组分里不使用细胞化学方法的情况下鉴定自噬体和自噬泡成为可能。

注意 当从正在培养的组织和细胞中分离细胞器时，使用不改变溶酶体和自噬体的膜的中断方法十分重要，这些结构对其中的一些程序尤为敏感。例如，聚四氟乙烯/玻璃马达均质化适用于与大量组织相连接的组织，如肝，但是对于循环细胞或者是正在培养的细胞，氮气蚀破环是保存溶酶体膜稳定的最好方法。在分离过程中，经常性的使用等渗溶液（如0.25M蔗糖）来避免低渗和细胞器的低渗损伤十分必要。在这一方面，因为溶酶体在高浓度下可以吸收蔗糖，所以在分离完整的与溶酶体相关的细胞器时使用蔗糖梯度不被看好。其它密度介质，如Nycodenz, metrizamide和Percoll，不能被转移到溶酶体内，所以更加适合于分离细胞器。

在分离细胞中其它的细胞器时，评估每次准备工作的纯度十分重要，由于过程中步骤很多，实验与实验之间往往存在相当大的变化。纯度的更正可以通过标记那些区室的酶或蛋白的恢复（匀浆中显示的总活性百分比）和浓缩（匀浆中特定活性的积累）的估计来完成（如β-氨基己糖苷酶常用于分析溶酶体的纯度）。沿着这些思路，在利用生化的方法研究自噬使用标记分子时保持平衡十分重要。有必要确保所有标记分子的活性都包括在内，并且没有发生对感兴趣的颗粒的过度伤害。因为定量的形态学研究费时的特点，所以该方法在更简单的生化方法建立起更可能得到有意义的形态学/体视学结果的情况之前不宜使用。

最后，值得注意并不是所有的溶酶体都是相同的。例如，如上文提到的，初级溶酶体，末溶酶体/次级溶酶体和自噬泡之间存在着差异。更进一步说，我们所说的“溶酶体”实际上是满足五个基本条件的多种多样的细胞器结构，pH<5.6，裂解蛋白酶，存在LAMP蛋白，单层膜结构，不存在内涵体和循环区室标记（如甘露糖-6-磷酸受体或Rab5）。但是即使满足这五个条件，我们仍可以清晰的根据蛋白质组和其它特征的不同来区分溶酶体，这些不同的溶酶体群体有可能参与到细胞的不同功能中。

11.在体内分析 在体内或器官中监测自噬通量是目前最不发达的，和细胞培养技术相关的理想方法似乎不存在。最有效的方法之一是GFPLC3/Atg8的分析（见前文的荧光显微镜）。用荧光显微镜或电子显微镜进行自噬结构（如自噬体）的形态学检测是一种方法，尽管可以准备和分析的部分的数量受到实际的限制。广泛的自噬可以引起细胞形态上的明显改变和细胞质数量的有效清除，导致细胞出现“空白”。另外一种有效的方法是免疫组织化学染色，这是一种关注自噬在保护免受神经退行性疾病中的作用，和在肌肉疾病，心脏病和回应贫血/再灌注中的可能作用的方法，样品可能限制于活体检查；然而，这种方法还没有受到广泛的评估，而且不能很好的用于动态分析中。一种已经用于在心肌细胞中检测自噬的方法是检测细胞质中的泛状颗粒夹杂物；然而，注意到这种夹杂物的存在实际上指示着自噬或自噬通量的减少十分重要。沿着这些思路，有必要注意LC3的免疫检测也可能使用组织切片。然而，在体内的分析很可能相对复杂一些。例如，骨骼肌中自噬的饥饿处理诱导在年轻动物（如4到5周龄的老鼠）中比在较老动物（如四个月大的老鼠）中的活性高。

一些生化的检测方法可以用来至少提供与自噬相关的间接数据，特别是当检测自噬在细胞死亡中的作用的时候。例如，细胞的生存能力与高组织蛋白酶B活性和低组织蛋白酶D活性有关。因此，相反的活性水平的出现可能是自噬（溶酶体）依赖的细胞死亡开始的信号。高活性和低活性可以通过与相同组织在控制条件下的，或同一生物不同组织里的活性相比较而得出，依赖于具体要分析的问题。最后，某些分子生物学分析方法可能也可以使用，例如，检测在自噬条件下出现的细胞角蛋白。

对于活体生物，甚至是在人体中可以使用一种微创的方法，这种方法通过在外周组织中检测动-静脉氨基酸交换速率来检测蛋白质吸收后的代谢过程。在人体中，外周组织中（多为骨骼肌）胰岛素和氨基酸敏感的后吸收（自噬）净蛋白代谢可以十分方便的通过确定氨基酸交换速率来检测，计算方法是股动脉和股静脉中的血浆氨基酸浓度的差值乘以血流速率。氨基酸交换速率的研究表明外周组织在进食后阶段吸收氨基酸，在后吸收（禁食）阶段释放氨基酸，例如，在血浆中胰岛素和氨基酸含量较低的阶段。这种后吸收释放氨基酸受到注入胰岛素和加入外源氨基酸的强烈抑制，说明它主要受蛋白质代谢溶酶体/自噬机制的介导。

最后，为了获得通量的数据，有必要包含一个时间历程参数来追踪底物积累的改变。这种方法的一个例子是果蝇blue cheese突变体的研究，在一个依赖时间的过程中积累泛素阳性包涵体。

注意 在检测泛素化聚合体时有一点需要注意，即泛素的积累可能指示自噬的阻碍，抑制蛋白酶降解，或者对应底物蛋白的结构改变阻碍它们的降解。此外，只有细胞质不包括核的泛素化是受自噬降解的。当检测组织蛋白酶D时，同时使用western印迹和活性检测是

可取的方法；单独进行活性检测可能被误导，因为前组织蛋白酶D也有活性。此外，意识到在正在进行自噬的组织里成熟的组织蛋白酶D含量通常比预期的含量低十分重要；前组织蛋白酶D在溶酶体内成熟，由于自噬导致的广泛的液泡化干扰酶经过内涵体的运输。因此，间接测量自噬时，前组织蛋白酶D和组织蛋白酶D的比例可能较高，或者组织蛋白酶B和组织蛋白酶D活性的比例改变（可能指示着自噬性细胞死亡的开始）。

C 值得特别注意的方法

1. Acidotropic染色 检测自噬最常用的方法之一是用acidotropic染料染色，如monodansylcadaverine(MDC), acridine orange, LysoSensor Blue和LysoTracker Red。

注意 尽管MDC最初被描述为自噬空泡的特异性标记分子，但是随后的研究表明它不是早期自噬体的特异性标记分子，而是标记降解过程的后期阶段，其它acidotropic染料也是这样。例如，自噬体不是酸性的，MDC染色可以在姿势缺陷突变体和缺少自噬活性的细胞中观察到。MDC也可以显示背景标记的混杂程度，除非使用窄通带滤波器。另一方面，在存在阻碍与溶酶体融合的长春新碱的情况下，MDC标记增加，说明在这种条件下，MDC可以标记晚期自噬体。沿着这些思路，过表达显性负调控类型Rab7的细胞显示出这种蛋白与MDC的共定位；在这种情况下，与溶酶体的融合也被阻断，说明MDC不仅仅标记溶酶体。最后，用自噬抑制剂渥曼青霉素或3-MA处理可以阻断MDC的标记。

总的来说，单独用MDC或它的衍生物monodansylpentane(MDH)染色不是监测自噬的有效方法。类似的，LysoTracker Red和acridine orange不是理想的标记分子，因为它们主要用于检测溶酶体。例如，LysoTracker Red已经被用于提供果蝇脂肪体细胞自噬的相关数据（图10）。然而，额外的检测，如GFP-Atg8/LC3或电子显微镜方法，在合适的时候使用以验证通过Acidotropic染色获得的实验结果的正确性。

对于一些染色结果解释的混乱，其部分原因是该领域术语的命名。实际上，在讨论acidotropic染料时指出了为什么要区分“自噬体”和“自噬空泡”，尽管二者偶尔不正确额互换使用。自噬体是由吞噬泡产生的隔离区室结构。自噬体和内涵体或溶酶体融合分别生成amphisome和自噬泡。早期自噬体不是酸性结构，amphisome和自噬泡是酸性的。这些结构曾被分别命名为“初始自噬空泡(AVi)”，“中间自噬空泡(AVi/d)”和“降解自噬空泡(AVd)”。因此，acidotropic染料可以染后期自噬空泡，而不能染初始自噬空泡自噬体。记住上述注意事项，自噬早期和晚期标记分子的结合使用是深受鼓舞的。事实上，早期自噬体标记分子和溶酶体区室扩张的特异性平行增加表明，融合/成熟过程是持续的。当定量分析哺乳动物细胞中的溶酶体时，重要的是要牢记溶酶体在大小和数量上的增加是能经常观察到的。最后，为了避免与植物及真菌液泡混淆，溶酶体的等价细胞器，我们建议使用“自噬体”代替“自噬空泡”，当结构的特异性特征不不明的情况下使用“自噬区室”。

2.自噬抑制和诱导 在很多情况下，确定自噬的抑制或诱导的影响十分重要（详见参考文献172中列举的部分调节物），在这方面值得注意。大多数自噬的化学抑制剂不是完全特异性的，最好使用特异性Atg功能缺失型突变体进行分析。然而，必须注意有些表面上特异性的Atg基因的产物可能具有不依赖于自噬的功能（如Atg5在细胞死亡中的作用）。因此，抑制剂应用于的实验条件和它们的副作用必须仔细考虑。此外，必须再次强调自噬是一个多步骤的过程，可以在不同的阶段被抑制。例如3-MA，LY294002和渥曼青霉素等隔离抑制剂可以抑制阶段I和阶段III的磷脂酰肌醇3-激酶活性。阶段I的酶的产物抑制自噬的隔离，而阶段III的产物一般刺激自噬的隔离。这些抑制剂的整体效果通常是阻断自噬，因为激活自噬所需要的阶段III的酶在负调控的阶段I的酶的下游起作用，尽管细胞死亡会在依赖于高水平蛋白激酶B才能生存的细胞中接着发生。尽管在孤立的肝细胞中无效，放线菌酮在体内分析中是很好的隔离抑制剂，在体外的某些类型细胞中也适用，它已经被用于检测

各种自噬元件回归分析的动态特性。在短期实验中放线菌酮起作用的机制还不是很清楚，但是与抑制蛋白质的合成没有直接关联。

大多数其它的抑制性药物在隔离后的步骤中起作用。这些类型的试剂已经被用于抑制内源性蛋白的降解和增加自噬区室的数量。它们引起在自噬体或自噬泡或两者中的隔离物质的积累，因为它们允许自噬隔离过程的进行。这些类别的抑制剂中主要的类别有，长春花生物碱（例如长春花碱），抑制融合的微管毒药，溶酶体酶抑制剂（如亮肽素，胃酶抑素A和E64d）和提高溶酶体pH的化合物（例如：空泡型ATP酶抑制剂如巴弗洛霉素A1，弱碱性胺，包括氨，甲基-或丙胺，氯喹，中性红，它们中有些减缓融合过程）。值得注意的是溶酶体酶一般分为三类（半胱氨酸，天冬氨酸，丝氨酸）。因此，实际上亮肽素，丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，有很少或没有效果并不一定表明酶体降解不发生；亮肽素，胃酶抑素A和E64d的结合使用可能更加有效。

与磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂相似，许多自噬化合物不是特异性的。例如，冈田酸是一种有效的1型（PP1）和2A型（PP2A）蛋白磷酸酶的抑制剂。巴弗洛霉素A1和其它提高溶酶体pH的化合物也许对酸性区室有间接影响。因此，尽管这些多种多样的试剂可以抑制自噬途径的不同步骤，解释自噬抑制的继发后果时必须考虑到它们的潜在副作用，尤其是在长期的研究过程中。例如，擒酶体化合物可以通过抑制TORC1来增加自噬体的形成速度。更进一步说，除了引起自噬区室的积累外，许多这些药物在许多类型的细胞中似乎刺激隔离体的产生，尤其是在体内。尽管清楚的知道为什么这些药物导致自噬区室的积累，但是为什么刺激隔离体的产生还不知道。一种可能性，至少是在肝细胞中，蛋白质降解的抑制减少了细胞内氨基酸含量，这反过来上调隔离过程。一个以时间历程为基础的细胞内和细胞外氨基酸所占比例的变化的研究可能为氨基酸代谢提供准确的信息。由于这些多种多样的原因，使用适当的对照物十分重要；沿着这些思路，雷帕霉素和氨基酸剥夺可以作为诱导自噬的显性对照。然而在许多类型的细胞中，雷帕霉素诱导自噬相对缓慢，使其有更多的时间产生间接影响。最后，最近的研究表明，专门类的化合物与α，β-不饱和酮结构趋于诱导自噬性细胞死亡，同时伴有线粒体形态上的变化。由于多种药物的处理导致的潜在多效性影响，使用本文中描述的方法证实自噬确实被抑制了是研究人员义不容辞的责任。

基因缺失（如短暂或永久的Atg-/- MEFs，或是在体内使用转基因敲除模型包括基于“条件”的Cre-lox敲除子）和功能性减弱子（如RNAi）的使用在可能的情况下是首选的方法，因为这些方法允许表型的直接检测。在某些情况下，使用敲除子或减弱子的方法检测多个自噬相关基因以排除所观察到的表型不是由于相应蛋白的非自噬功能的结果的可能性是可取的，尤其是检测自噬引起的细胞死亡的可能性时候（相反，如果检测扰动是否会通过自噬诱导底物的清除，单个Atg基因的敲除可能就足够了）。特别是在评估Beclin 1的情况下，它和抗凋亡Bcl-2蛋白家族相互作用，或者是当低含量的底物足以保持自噬过程的时候，例如Agt5。沿着这些思路和上文中对于抑制剂的使用的陈述，当使用敲除子或者特别是减弱子的方法时，再一次提出使用本文中描述的方法证实自噬确实被抑制了是研究人员义不容辞的责任。最后，我们注意到基因敲除或减弱的长期继发后果比自噬受到抑制的即时效果更加复杂。为了克服这个问题，四环素调节的Atg5基因的可逆敲除细胞可能是有用的。另一种特异性干扰自噬的策略是使用显性负调控抑制剂。通过瞬时转染，腺病毒，或者是TAT介导的蛋白转导的方法来转运这些试剂为在培养中的细胞或体内使用这些药物提供了可能。然而，由于对许多类型的细胞和组织而言自噬是一个重要的代谢过程，当分析与细胞死亡无关的问题时，抑制自噬引起的细胞丧失生存能力需要研究人员的关注。

起诱导自噬作用的化合物很少，但是自噬过程最初的表征很大程度上受胰高糖素诱导的影响，胰高血糖素通过激活LKB1-AMPK间接抑制mTOR。目前，最常用的自噬特异性诱导物是雷帕霉素，它直接抑制mTOR。不依赖于TOR的调控可以通过锂，丙戊酸钠和carbamezapine

实现，这些化合物降低肌醇-1，4，5-三磷酸腺苷的含量。我们对通过Atg蛋白的直接调节所知甚少，但有一些迹象表明，它莫西芬通过增加Beclin 1的表达来起到诱导自噬的作用。最后，新的检测已经发现不依赖于雷帕霉素诱导自噬的小分子，并且允许清除错误折叠的或易聚合的蛋白质，这表明他们可能被证明在治疗中的应用非常有用。

3.实验系统 纵观这些准则，我们也注意到，这是不可能说出可以适用于所有的实验系统的明确规则。例如，一些技术手段可能不可以应用于某种特定类型的细胞或生物中。在某些情况下这必须凭经验确定，这也是包括适当对照物的重要原因之一。在体内或灌注的器官中和培养中的细胞中研究存在差异。例如，胰岛素对悬浮老鼠肝细胞中的水解没有影响，相反对灌注的老鼠肝脏有影响。然而当分离的肝细胞在固定的培养皿中培养时或是允许其在基质中固定下来时，胰岛素的功能重新体现。这一现象的原因可能是通过胰岛素和一些氨基酸调控自噬需要借助整合基质相互作用的体积感应和微管的完整性。因此，时刻注意从一个特定系统中得到的结果不一定广泛的适用于其它的实验中十分重要。

结论和前景展望

总之，我们推荐了一系列在高等真核生物中监测巨自噬的方法（表1）。重要的是，调查人员需要确定他们是在评估自噬水平还是自噬通量。如果问题是某一特定条件是否改变自噬通量（如自噬底物运送到溶酶体或植物液泡的速率及之后的降解），那么自噬体稳态的检测（如通过GFP-LC3亮点计数，监测LC3-II的数量而不检测周转周期，或者电子显微镜）作为单一的方法是不够的。在这种情况下直接检测自噬泡的通量和/或自噬底物的通量（如野生型细胞和自噬缺陷型细胞相比，后者通过自噬抑制剂处理或减弱Atg基因获得）也是有必要的。总的来说，当条件允许时，我们强烈建议使用多种检测方法，而不是依赖于单一方法得到的结果。

作为最后的提醒，我们在这篇评论的开始说的那样，这套使用指南不是公式化的规则，因为适当的检测方法部分地取决于那些所需要解决的问题和正在使用的系统。相反，这些指导方针的提出主要是为了强调需要解决的关键问题，如检测自噬区室和通量或底物清除的差异；他们的目的不是为了限制富有想象力的方法用于监测自噬。我们希望监测自噬的新方法能够被不断的开发出来，新的发现可以改变我们对现有检测方法的看法。例如，前景广阔的一个领域是利用纳米粒子作为工具来监测自噬过程，它们可以用于电子显微镜中（如使用不同大小和形状的纳米粒子进行对比）或是在活细胞中追踪自噬通量（如依赖于稳定的荧光量子点）来追踪自噬体和amphisomes。和自噬过程相似，这是一个充满活力的领域，我们需要保持灵活的运用我们的标准。