南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（10）：1924-1932·1924·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com49卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.10.04基于SSR分子标记分析海南地区甘薯
种质材料的亲缘关系
邓吉良，孙言博，吴
跃，黄绵佳，周其良，朱国鹏，祝志欣*
570228）
（海南大学热带农林学院，海口
摘要：【目的】分析海南地区甘薯种质材料间的亲缘关系，为海南地区甘薯种质资源的鉴定、引进和分子育种提供理论依据。【方法】从海南省及周边地区收集甘薯种质材料，从中筛选出长势较好的64份甘薯种质材料，利用30对SSR引物对其DNA进行PCR扩增，并进行UPGMA聚类分析及遗传距离分析，以期阐明其亲缘关系。【结果】30对引物共扩增得到161个清晰条带，其中多态性条带为135个，多态条带百分率达83.9%，平均每对引物扩增5.37个等位基因，各引物的多态信息含量（PIC）为0~0.75，平均为0.44。聚类分析结果表明，64份甘薯种质材料间的遗传相似性系数为0.74~0.98，平均为0.78，在遗传相似性系数0.75处可分为I、II和III三大类，86%甘薯种质材料归为第I类，遗传相似性系数总体较高；大部分采自海南的未知甘薯种质材料与采自江苏的材料关系较远，来自同一地区的材料分散于各个分支，无明显的地域性。64份甘薯种质材料间的遗传距离为0.02~0.37，平均为0.22，遗传距离整体较近。【结论】海南地区甘薯种质资源间的亲缘关系较近，遗传背景狭窄，可能是海南地区高温高湿、高光照等气候条件自然选择的结果。海南地区可适当引进亲缘关系较远的优质甘薯品种，促进种质创新，丰富海南甘薯的遗传资源。
关键词：甘薯；亲缘关系；SSR；遗传相似性系数；聚类分析；海南中图分类号：S531.024
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2018）10-1924-09
PhylogeneticrelationshipofsweetpotatogermplasmsinHainan
basedonSSRmolecularmarkers
DENGJi-liang，SUNYan-bo，WUYue，HUANGMian-jia，ZHOUQi-liang，
ZHUGuo-peng，ZHUZhi-xin*
（InstituteofTropicalAgricultureandForestry，HainanUniversity，Haikou570228，China）
Abstract：【Objective】ThephylogeneticrelationshipamongthesweetpotatogermplasmsinHainanwasanalyzedto
providetheoreticalbasisfortheidentification，introductionandthebreedingofhighqualitysweetpotatogermplasmsinHainan.【Method】SweetpotatogermplasmswerecollectedfromHainanandthesurroundingareas，and64sweetpotatomaterialswithfinegrowthsituationwereselected.ThirtypairsofSSRprimerswereusedtoconductPCRamplificationonDNAofthe64sweetpotatomaterials.UPGMAclusteringandgeneticdistanceanalysiswerecarriedouttoelucidatetheirphylogeneticrelationship.【Result】Using30pairsofSSRprimers，atotalof161clearbandswereamplified，including135polymorphicbands.Thepercentageofpolymorphicbandsreached83.9%.Eachpairofprimersamplified5.37allelesonaverage.Thepolymorphicinformationcontent（PIC）oftheprimersrangedfrom0to0.75，withanaveragePICof0.44.UPGMAclusteringshowedthatthegeneticsimilaritycoefficientofthesesweetpotatogerplasmswas0.74-0.98，withanaverageof0.78.Atthecoefficientof0.75，thesematerialscouldbedividedintothreecategories:I，IIandIII.Amongthem，86%materialsbelongedtoclassI，andtheoverallgeneticsimilaritycoefficientwashigh.MostoftheunknowngermplasmscollectedfromHainanwerefarfromthosecollectedfromJiangsu.Thematerialsfromthesameareascatteredindifferentbranches，displayedweakregionalism.Thegeneticdistanceamongthetested64materialswas0.02-0.37，withtheaveragevalueas0.22，showingclosegeneticdistance.【Conclusion】ThesweetpotatogermplasmsinHainanhaveclosephylogeneticrelationshipsandnarrowgeneticbackground.Thisphenomenonmightbetheresultsofnaturalselectionofthelocalclimate，suchasthehightemperature，highhumidityandhighlightconditionsinHainan.High-qualityanddistantlyrelatedgermplasmsofsweetpotatomaybeintroducedtopromotegermplasminnovation，andenrichthege-neticresourcesinHainan.
Keywords：sweetpotato；phylogeneticrelationship；SSR；geneticsimilaritycoefficient；clusteringanalysis；Hainan收稿日期：2018-04-13
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31660074）；海南省自然科学基金项目（317012）作者简介：*为通讯作者，祝志欣（1986-），博士，主要从事甘薯生物学研究工作，E-mail：zhxzhu@126.com。邓吉良（1993-），研究
方向为植物分子生物学，E-mail：dddjiliang@163.com
10期邓吉良等：基于SSR分子标记分析海南地区甘薯种质材料的亲缘关系
·1925·0引言
【研究意义】甘薯［Ipomoeabatatas（L.）Lam.］为旋花科番薯属植物，起源于美洲地区，在明代传入我国后被广泛种植（Zhangetal.，2004）。目前，甘薯已成为我国重要的粮食、工业原料和饲料作物，具有很高的开发利用价值（黄咏梅等，2008；李元元等，2017）。我国不同地区气候差异明显，种植的甘薯品种也不同，选育适合各地种植的优良甘薯品种是甘薯产业发展的关键。甘薯栽培种为六倍体，基因组高度杂合，育种中产生的优良性状和杂种优势主要通过无性繁殖保留下来（贺学勤等，2005）。截至2015年，我国已收集保存甘薯种质资源2000余份，育成品种超过500个，可适应于不同的栽种地区（张超凡，2010；张道微等，2015）。海南岛属热带地区，是我国重要的南繁育种基地，其温度和光照可满足甘薯开花结籽条件，为甘薯的育种和周年生产提供了有利的自然环境。但海南地区甘薯产业相对落后，存在甘薯品种结构不合理、优良品种较少、老品种种性退化、品种混杂及本地品种间的遗传关系不明确等问题（黄洁等，2005；朱红林等，2012；郑有东，2014）。因此，阐明海南地区甘薯品种间的亲缘关系，对海南优质甘薯种质资源的发掘、引种及新品种选育具有重要意义。【前人研究进展】甘薯遗传背景复杂，表型易受环境影响，因此，与传统的农艺性状测定方法相比，分子标记技术可更准确地反映作物的遗传多样性和亲缘关系，具有不易受环境影响、重复性好和标记数量大等优点（Wangetal.，2011；杨新笋，2016；周丽霞等，2017；董玲霞等，2018）。贺学勤等（2005）利用RAPD、ISSR和AFLP分子标记分析48个甘薯品种的遗传多样性和亲缘关系，结果发现这3种分子标记技术均反映出甘薯品种间存在丰富的遗传变异和较远的亲缘关系。甘学德（2010）利用ISSR分子标记对49份从国内外收集的甘薯种质材料进行亲缘关系分析，结果发现其遗传相似性系数为0.58~0.93，平均为0.70，在0.70处可将其划分为四大类群，表明供试甘薯总体上存在一定的遗传差异，仅部分种质间存在较近的亲缘关系。赵冬兰等（2011）采用20对SSR引物对24份甘薯种质材料DNA进行PCR扩增，结果显示甘薯间的遗传相似性系数变幅较大，为0.57~0.93，平均为0.74，表明供试甘薯种质材料的遗传多样性较丰富。张安世等（2015）利用12对ISSR引物对22个甘薯品种进行聚类分析，具有相同亲本的甘薯品种未聚为一类，且部分品种聚类结果与地理分布呈一定的相关性，表明甘薯间遗传关系较复杂。
南文卓等（2016）利用11对SSR引物对30份引种的甘
薯种质材料DNA进行PCR扩增，多态性条带占比达93.0%，遗传相似性系数为0.42~0.96，平均为0.62，表明供试甘薯种质材料的遗传多样性较丰富。以上研究可看出，多种分子标记技术已广泛应用于研究甘薯品种的亲缘关系。【本研究切入点】目前，海南甘薯品种混杂，亲缘关系不清，种质资源的评价与鉴定主要采用农艺性状测定的方法（宋付平等，2009）。鲜见采用SSR分子标记对海南省甘薯种质资源进行亲缘关系分析的文献报道。【拟解决的关键问题】利用30对SSR引物对64份甘薯种质材料DNA进行PCR扩增，并进行UPGMA聚类分析及遗传距离分析，以期阐明其亲缘关系，为海南地区甘薯种质资源的鉴定、引进和分子育种提供理论依据。
1材料与方法
1.1
试验材料
从海南省及周边地区收集甘薯种质材料，通过两年的统一种植及表型观测，从中筛选出64份在海南地区长势较好的甘薯种质材料（表1），其中有46份未知名的甘薯种质材料为本研究根据来源地自行定名，其他18份为已知甘薯品种，由于广薯87、红遥、宁紫薯1和川山紫在前人研究（南文卓等，2016）中分属不同分支，故本研究以其作为对照。以上材料均统一种植于海南大学海甸校区农科基地和文昌甘薯种植基地。SSR引物由江苏徐州甘薯研究中心曹清河研究员提供。
主要试剂：2×SuperMasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺购自美国Amresco公司；过硫酸铵和TEMED购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；剥离硅烷购自北京索莱宝科技有限公司；甲醛和硝酸银购自广州化学试剂厂。所有化学试剂均为分析纯。
主要设备仪器：T960PCR仪［力新仪器（上海）有限公司］、Nanodrop超微量紫外分光光度计（Ther-moFisher，美国）、冷冻离心机（Eppendorf，德国）、水平电泳仪（北京六一仪器厂）、琼脂糖水平电泳槽（北京六一仪器厂）、DYCZ-30C型电泳仪（北京六一仪器厂）和恒温水浴箱（北京六一仪器厂）等。1.2试验方法
1.2.1DNA提取采集甘薯植株的顶端幼嫩叶片1~2片，每份种质材料取3~4株，采用CTAB法提取其DNA（李强等，2007），并利用NanoDrop2000分光光度计测定其浓度，然后统一稀释至100ng/μL，用作PCR扩增的DNA模板。
·1926·南方农业学报49卷表164份甘薯种质材料名称及来源地
Table1Namesandoriginsofthe64sweetpotatogermplasmsinthisstudy
编号甘薯名称来源地
编号甘薯名称来源地
No.SweetpotatoOriginNo.SweetpotatoOrigin1徐薯18江苏33文昌5号a海南文昌2海口1号a海南海口34三角宁海南演丰3迈号1a海南迈号35海口三角宁a海南海口4迈号3a海南迈号36文昌本地微紫a海南文昌5迈号4a海南迈号37迈号9a海南迈号6迈号5a海南迈号38迈号10a海南迈号7迈号红达a海南迈号39文昌6号a海南文昌8美国3号b美国40文昌7号a海南文昌9美国2号b美国41迈号11a海南迈号10迈号越南紫薯a海南迈号42迈号12a海南迈号11美国1号b美国43海口4号a海南海口12迈号美国a海南迈号44文昌8号a海南文昌13迈号6a海南迈号45文昌9号a海南文昌14迈号美国3号a海南迈号46澄迈2号a海南澄迈15迈号7a海南迈号47海口2号a海南海口16迈号8a海南迈号48海口3号a海南海口17迈号金峰1号a海南迈号49湘1号b湖南18徐菜薯1江苏50儋州1号a海南儋州19广菜薯6广东51迷你薯江苏20广菜薯2广东52福建1号b福建21徐菜薯2江苏53福建紫福建2265-6江苏54澄迈3号a海南澄迈23徐紫薯8江苏55定安1号a海南定安24广菜薯3广东56福建3号b福建25福薯76福建57儋州2号a海南儋州26苏薯53江苏58南京1号b江苏27澄迈1号a海南澄迈59冀口1号b河北28文昌2号a海南文昌60观赏2江苏29文昌3号a海南文昌61广薯87广东30台湾1号b中国台湾62红遥日本31台湾2号b中国台湾63宁紫薯1江苏32文昌4号a
海南文昌
64川山紫
日本
a表示从海南省内收集的未知甘薯材料，共36份；b表示从我国其他地
区或其他国家收集的未知甘薯材料，共10份；未标注的为已知甘薯材料，共18份
aindicatedunknowngermplasmsofsweetpotatocollectedinHainan，36germplasmsintotal；bindicatedunknowngermplasmsofsweetpo-tatocollectedinotherareasofChinaorothercountries，10germplasmsintotal；theremainingunlabeledgermplasmswereknownsweetpota-to，18germplasmsintotal
1.2.2PCR扩增利用30对SSR引物（表2）分别对64份甘薯种质材料DNA进行PCR扩增。反应体系10.0μL：2×SuperMaserPCRMix5.0μL，100ng/μLDNA模板1.0μL，10μmol/L正、反向引物各0.5μL，去离子水补足至10.0μL。采用自行开发的双温PCR扩增程序，即采用“高—低”两种退火温度，先用高退火温度（Tm+5℃）的循环以保证扩增的特异性，再采用低退火温度（Tm-5℃）的循环保证扩增效率，具体的循环数目可根据试验调整。本研究具体扩增程序：94℃预变性4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共20个循环；94℃30s，50℃30s，72℃1min，共15个循环；72℃延伸10min。取1.0μL
PCR产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色，并拍照观察。1.3统计分析
观察并统计扩增出的等位基因条带，分别用数字1和0代表各等位基因条带的有和无，建立1和0的二元矩阵，并利用NTSYSpc2.1对供试甘薯种质材料进行UPGMA聚类分析和遗传距离分析。
2结果与分析
2.1
多态性分析结果
利用30对SSR引物对64份甘薯种质材料的DNA进行扩增，结果如表3所示。30对引物共扩增得到161个有效条带，每对引物扩增1~12个条带，条带大小主要集中在100~500bp，平均每对引物扩增5.37个等位基因，其中多态性条带为135个，多态条带百分率达83.9%。各引物的多态信息含量（PIC）为0~0.75，平均为0.44。总体上看，30对SSR引物的多态性较好，可用于区分部分甘薯种质。图1和图2分别显示两对代表性引物的扩增结果，引物C59扩增条带较少但清晰易读（图1），引物Z37扩增的条带较多但不易读取（图2）。2.2SSR聚类分析结果
基于30对SSR引物的扩增结果，对64份甘薯种质材料进行UPGMA聚类分析，结果如图3所示。遗传相似性系数在0.74~0.98，平均为0.78，遗传背景总体较近。在遗传相似系数0.75处，64份甘薯种质材料可分为三大类，其中第II类仅包括1份材料，为采自海南文昌地区的文昌4号；第III类仅包括2份材料，为采自江苏的南京1号和宁紫薯1，第I类则包括剩余的61份材料，占供试材料总数的86%。在0.78的相似性系数处，第I类又可分为Ia、Ib和Ic亚类，分别包括55、4和2份材料。在遗传相似性系数0.79处，Ia又可分为5个分支，其中Ia-1和Ia-2分支主要为采自江苏、广东等地的外地材料，共计23份；Ia-4分支包括23份材料，为最大的一个分支。在广薯87、红遥、宁紫薯1和川山紫4个对照品种中，除宁紫薯1属于第III类外，其他3个均位于Ia-4分支的3个小分支上，分布较离散。总体而言，大部分采自海南的未知甘薯种质材料与采自江苏的材料关系较远，且来自同一地区的材料分散于各个分支，并未按照地区聚类，无明显的地域性。
由图3还可知，Ia-1分支内的迈号1与迈号4、文昌3号与台湾1号及Ia-2分支内的文昌2号与台湾2号的遗传相似性系数均达0.98。虽然这3对材料间遗传相似性系数较高，田间表型也较相似，但部分性状存在差异，如迈号1和迈号4均采集自迈号地区，外形
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