2细胞培养及建立泡沫细胞模型

2)实验手段

(1)细胞培养及建立泡沫细胞模型

将THP-1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于370C, 5} CO:培 养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间 大约在26 h后。细胞浓度控制在106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。细胞复苏 后，传至3 }= 5代后方可用于建模。 (2)建立巨噬细胞模型

取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为106/mL，接种于6孔培 养板，每孔2 mL。正常组在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养。模型组先

置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基础培养液中培养72 h，贴壁后轻轻吸去上清液， PBS洗3遍，更换10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，即得巨噬细胞。巨噬细胞的鉴

定己在发表文献中完成。

(3)建立巨噬源性泡沫细胞模型

将获得的巨噬细胞更换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为80 mg/L

的Ox-LDL，共同孵育48 h，油红。染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得泡沫

细胞模型，此过程即为泡沫化。

(4)针对CaSR的si RNA的构建及转染

根据公认的si RNA设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)设计针对CaSR的3 条siRNA，选用验证后效果最好的一条。同时合成阳性对照和阴性对照。转染试剂选用

Invitrogen公司生产的LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagento siRNA目标序列的选取原则:

工从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找‘`AA'’二连序列，并记下其3’端的19

个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA要比那

些GC含量偏高的更为有效;在设计siRNA时不要针对_5’和3’端的非编码区 Cuntranslated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响

siRNA的效果。

1)细胞总RNA提取:按Trizol试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下:在细胞

中加入冰预冷的Trizol试剂，室温静置_5 min;加200 } 1氯仿，充分摇匀1_5sec，室温静

置2-3 min ; 4 0C，12000rpm离心1 _5 min，取上层无色水相层转移至新EP管;加等体积

异丙醇，室温静置l Omin } 4 0C } 12000rpm离心l Omin，管壁底处可见乳白色沉淀，即

为RNA;弃上清，加7 _5%乙醇1 ml } 4 0C } 7_500rpm离心_5 min，洗涤二次;弃上层乙

醇，无菌环境风干RNA沉淀。用20州DEPC处理的双蒸馏水(ddH20)溶解RNA沉淀， -80 0C备用;取4川总RNA加至200川灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其ODZ}o和

ODZSo，计算ODZ}o/ODZSo。样品总RNA < ug枢1) = OD26ox40x稀释倍数(50 ) /1000 o OD26o

/ODZgo在1.8-2.0之间为样品较纯。

2)反转录反应:在20川反应体积中进行，成分如下:总RNA tug (5川)，随机引

物1 } 1 } DEPC处理的ddH20 4.5}1} 70 0C冰浴l Omin;加10林1逆转录反应液(l Oxbuffer 2}1

MgCL24}1} dNTP2}1} inhibitor0.5}1，逆转录酶1}1)} 420C冰浴60min } 99 0C冰浴_5 min

-20 0C保存备用。

3)引物扩增设计:根据Genebank序列，设计各个引物序列并合成。

4)实时定量PCR实验方法:使用宝生物工程(大连)有限公司的SYRB. Premix Ex TaqTM和Light Cycler PCR扩增仪(Roche)进行荧光扩增;求出CT值。 (6)激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定THP-1细胞内游离钙的变化

取6孔板进行THP-1细胞培养，事先在6孔板中加入盖玻片。取6孔培养板中的盖玻

片，D一Hanks液冲洗2遍，用1OO}L的钙离子探针Fluo-3 /AM与F-127混合工作液

(10 }mol/L

Fluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于盖玻片上，370C避光40 min } D一Hanks液再次冲洗玻片3

遍，洗去多余染料，保留少许D-Hanks液平衡细胞10 min，分组施加因素后，于10 min内利用

LSCM进行细胞内Ca2+浓度检测。 (7)油红O染色

油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三醋结合呈小脂滴状。脂

溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片

置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红 色。

细胞接种于6孔培养板内，诱导建模结束后，吸去上清液，用PBS洗三次，冰冻的4}

多聚甲醛固定_5 min， PBS洗一次，再置于丙二醇中固定_5 min，轻轻吸去丙二醇，加入0. _5%油红O的丙二醇溶液，置60℃烤箱中染色1 _5 min，用8_5%丙二醇冲洗_5 min，再用

PBS洗三次，蒸馏水清洗1次，苏木素复染2-5 min } 1 07oHCL分色及返蓝后封片。置显微

镜下观察并摄像，细胞内脂质为红色，胞核为蓝色。

参考文献:Zheng XD, Li Q, Tang XB, Liang SJ, Chen LP, Zhang S, Wang ZG, Guo L, Zhang R, Zhu DL. Source of the elevation

Ca2+ evoked by I S-HETE in pulmonary arterial myocytes. European Journal of Pharmacology 2008;601:16-22

(8)细胞内胆固醇含量的测定

细胞内胆固醇的提取:细胞接种于6孔培养板内，培养结束后，吸去上清液，冰预冷

PBS洗三次，用细胞刮刀刮取细胞，加1 mL冰预冷0.9%生理盐水重悬细胞，反复冻融三

次，冰浴中超声破碎_5 min，得细胞裂解液，分装，每份200匹，-700C贮存，用于测定

总胆固醇和游离胆固醇。

总胆固醇的提取:取160}L上述细胞裂解液，加300}L 15 } KOH乙醇溶液，_50 0C水

解2h，加正己烷一异丙醇(4:1)SOO}L}涡漩30 s } 40C下3600 r/min离心_5 min，取上层。继

用正己烷一异丙醇(4:1)如上法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加20}L

内标储备液，用甲醇并定容至2 mL，摇匀，作为总胆固醇供试品溶液。

游离胆固醇的提取:取160}L上述细胞裂解液，加300}L乙醇，加正己烷一异丙醇 (4:1)500匹涡漩30 s } 40C下3600 r/min离心_5 min，取上层。继用正己烷一异丙醇(4:1)如上

法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加20}L内标储备溶解并定容至

2mL，摇匀，作为游离胆固醇供试品溶液。

HPLC测定胆固醇:色谱柱:Hypersil C 18柱(2.1 mmx150 mm} 3}m);流动相:甲 醇一水(90:10);流速:0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10 }Lo

参考文献:唐朝克，王佐，易光辉，万载阳，刘录山，袁中华，王燕，危当’}亘，阮长耿，杨永宗.Rolipram对THP-1巨

噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响.中国药理学通报.2003 oct;19(10):1177-82

(9) ELISA法检测细胞因子的分泌情况

按每孔2x1护个细胞接种于24孔板中，含有160nmo1/L PMA的培养液培养72小时后，

PBS洗三遍，各组加入处理因素，继续培养24小时。收集细胞培养上清液。从平衡至室

温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔。加O.lml离心后的细胞培养上清液于反应 孔中，置370C孵育90分钟。然后洗板_5次。(同时做空白孔，标准品空)。于各反应孔中，

加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1m1} 370C孵育1小时，洗板_5次。加酶结合工作

液O.lml} 370C避光孵育30分钟，洗板_5次。加入O.lml显色底物液，370C避光孵育1 _5分钟于各反应孔中加入终}卜液O.lml}混匀后即可测量ODq50值。

(10)Western Blot检测蛋白表达变化

1)总蛋白的提取:收集细胞，加入冰预冷的蛋白裂解液(lmmol/L PMSF } pH7.4) 混匀，超声破碎细胞;4 0C } 12000rpm，离心1 _5min，取上清液，用考马斯亮蓝法染色，

测定蛋白含量;取上清加入_5*上样缓冲液(体积比4: 1)} 1000C沸水中煮_5 min，-20 0C 备用。

2 ) SDS-PAGE电泳:按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶，电泳置染料抵达分 离胶底部，断开电源，取下凝胶。切下带有要转移蛋白泳道的凝胶，右下角作一标记以

确定方向及正反而。

3)转膜:剪1块与凝胶大小相同的NC膜(不能大于凝胶)，右下角作一标记，浸 泡于转移缓冲液中，大约_5 min o剪8块滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相同 (不能大于凝胶)。将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极(从下至上)川页 序安装转移装置:平放底部电极，在底部电极上放置4张浸泡好的滤纸，精确对齐，将 NC膜放在滤纸上，排除气泡。把SDS-PAGE电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗，平 放于NC膜上，用玻棒挤出所有气泡，在其上再放置4张浸泡好的滤纸，排出气泡。将 上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶而积按1 mA/cm2接通电源。

4)封1}7:转移结束后，在TBS-T液内清洗20min，加_5%脱脂奶粉，37 0C封闭lho _5)一抗孵育:封闭结束后，用TBS-T稀释第一抗体，将NC滤膜置于其中，4 0C 震荡过夜。

6)显迹:TBS-T液漂洗NC膜3次/l Omin，将膜与TBS-T稀释二抗孵育，室温下 振荡1h; TBS-T漂洗NC膜3次/lOmin; TBS液漂NC膜3次/l Omin } X光胶片上曝光，

随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析。 (11)免疫荧光技术检测蛋白表达定位