DNA提取实验报告

生物学大实验（二）

实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验 实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生

物学基本技术的理解和掌握。 实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、

磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。 实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 实验步骤： 一 质粒扩增

（1）普通lb固体培养基制备： 制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。 （2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分) 二 质粒dna的提取(碱法) 1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；

2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。 3、 加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。 4、 加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。 5、 加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀

地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。 6、 取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。 7、 弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加 入预冷的1ml 70％乙醇。

8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。 9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 10 、 将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中 三dna酶切反应 1、 将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入dna（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱

的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），

37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。 3、 每管加入2υl0.1mol/l edta（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。 四 dna的琼脂糖凝胶电泳

1、 取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。

2、 胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml 0.5×tbe稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

3、 胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（eb）溶液使其终浓度为0.5υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5υ×

tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面 4、 加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶

或将样品槽底部的凝胶刺穿 5、 电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v，电流在

40ma以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳 6、 观察和拍照 五 实验结果 六 实验结论 通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根没有被酶切，质

粒dna跟rna同时存在，出现了两条亮带，质粒dna跟rna分离效果较好。 本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项： （1） 取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且要

垂直拔出；

（2） 点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶； （3） 电泳时，电极一定要连接正确 （4） 染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使

用后废液不可不可随意丢弃。 生物科学 071班 姓名：刘欢 学号：20073305篇二：dna的提取和电泳实验报告 基因组dna的提取和电泳（实验五）实验报告 一、实验目的

了解dna提取的方法，以及琼脂糖凝胶电泳分析dna技术。 二、器材和试剂 1. 器材

水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等 2. 试剂

1. 1mol/l tris.cl(ph8.0) 的配制：称取12.11g 的tris，置于80 ml的ddh20,加入浓盐酸

（约4.2 ml）,调节ph值至8.0，定容至100 ml。 2. 0.5 mol/l edta(ph8.0)的配制：18.61g na2edta·2h2o，加入80 ml的ddh2o,用naoh颗粒调ph值至8.0（约需2 g），定容至100 ml。 3. 提取缓冲液的配制： 100 mmol/l tris.cl(ph8.0), 20 mmol/ledta, 500 mmol/l nacl,

1.5%sds

4. 80/4/16氯仿：异戊醇：乙醇 5. 6?loading buffer：0.15％溴酚蓝，0.15％二甲苯青ff，5 mmol/l edta，50％甘

油 三、实验步骤

1. 在15ml的离心管中加入5ml的提取缓冲液，60℃水浴预热。 2. 植物叶1-2g，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状， 60℃水浴保温20 min，其间不时缓慢摇动。 3. 5000 rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中， 4. 加入5 ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤），室温下静置

5-10分钟，使水相和有机相混匀。 5. 室温下离心5000 rpm离心5分钟。 6. 仔细吸取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出 现絮状沉淀。

7. 离心5000 rpm，离心5 min，弃去异丙醇，室温晾干。 8. 视沉淀多少，加入1ml左右ddh2o溶解，可在60℃水浴中放置15分钟以上助溶。 9. 取dna样品5 μl，加入1 μl6?loading buffer，混匀，加入0.7%的琼脂糖凝胶加样孔

中，电泳，检测dna的分子大小。 4、实验结果和讨论 实验分析：本次实验由于种种原因我是和植保102班的同学一起做的，我们组3人，实

验过程比较严谨，受到了老师的表扬，实验结果也很令人满意。 下面是实验过程中的注意点：1、研磨不能太久太用力，会导致dna片段断掉。2、实验

室的某些试剂，如氯仿，有毒性，应带手套进行。 电泳的时候不知是时间的原因还是都做得不错，结果相差不是很远（如上图），第五组和第六组是我们的，第六组是我自己加的。实验过程中要耐心细心，这样才能得到满意的结果。 园艺101

石颖 20100107011篇三：浙大生化实验报告dna的提取 实验报告 课程名称： 生化实验甲 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称：植物基因组dna的提取 实验类型： 生化定性实验 同组学生姓名： 及纯度与含量的测定 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验

步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组dna的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组dna结果的初步分析； 4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量的方法。 二、实验基本原理 植物基因组dna的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（ctab)法、十二烷基硫酸钠 (sds)法。十六烷基三甲

基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和 核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使dna得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(dna、rna)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使dna沉淀，沉淀dna溶于te溶液

中，即得植物基因组 dna溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导dna降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的ctab-dna提取法步骤多，较烦琐，dna产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。sds法操作简单，温和,也可提取到较高分子量dna，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响dna的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对dna的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入

抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 本实验采用十二烷基硫酸钠 (sds)法提取植物基因组dna，基因组dna提取后， ①通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dna分子量大小、纯度；②用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量。

dna的琼脂糖凝胶电泳鉴定: dna分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。dna分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的dna片段泳动速度不同。dna片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（eb）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定dna片断在凝胶中的位置。

紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量 核酸——dna和rna所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收

的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。 波长为260nm时，dna或rna的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。

对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，dna钠盐的od260＝0.02。 当od260＝1时，双链dna含量约为50μg / ml 单链dna含量约为37μg / ml rna含量约为40μg / ml

寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异） 1、核酸样品dna、rna含量的测定： 如用1cm光径石英比色皿，用 h2o稀释dna或rna样品n倍并以h2o为空白对照，根据

此时读出的od260值即可计算出样品稀释前dna的含量： dna（μg/μl）=50×od260读数× dna样品稀释倍数/1000 rna（μg/μl）=40×od260读数× rna样品稀释倍数/1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙

锭法或其他方法进行估算。 当dna样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响dna吸光度的准确测定。由于 dna在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230，计算它们的

比值来判断核酸样品的纯度。

2、核酸样品纯度判断的一般标准： ⑴ dna纯度：od260/od280≈1.8，表示为纯的dna； od260/od280 ＞1.9，表示有rna污染； od260/od280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 ⑵ rna纯度：1.7 ＜od260/od280＜2.0，表示为纯的rna； od260/od280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染；

od260/od280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 ⑶ od230/od260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷

酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和pcr的效果。 三、实验材料与试剂

1、实验材料：植物幼嫩叶子 2、实验试剂

（1）基因组dna提取缓冲液 （2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液 （3）te缓冲液 （4）平衡酚： （5）rna酶a （6）酚/氯仿 （7）氯仿/异戊醇

（8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/l naac （10） 5×tbe缓冲液

（11） 6×电泳上样缓冲液 （12） 1.0%琼脂糖凝胶 （13） eb

（14） dna分子量markers：125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp. （15） ddh2o； 四、实验器材与仪器 1、研体

2、离心机、离心管（7ml、5ml）及离心管架； 3、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 4、恒温水浴箱65 ℃ 5、制冰机； 6、冰箱；

7、恒温水浴箱 37℃； 8、微波炉；

9、电泳仪及电泳槽； 10、紫外检测仪。 11、紫外分光光度计； 12、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。 （二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna 1、制胶（1％琼脂糖凝胶）（此步骤由实验室老师准备） 在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5×tbe电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入eb，使其终浓度为0.5mg/l，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×tbe（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。（注：eb为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作） 2、加样

取5ul纯化的dna原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加