01基因工程复习题（答案版）

建议必选DD RT-PCR和SSH，原因请看下题）？ 1）差减杂交（SH）

通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。

2）抑制性差减杂交（SSH）

SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。 3）差异显示PCR（DD RT-PCR）

利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。 4）DNA代表性差异分析（DNA RDA） 代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA，driver DNA）与野生型（检测DNA，tester DNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。 5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）

基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。 [参考文献：关德军.AFLP技术原理及其在植物研究中的应用.安徽农业科学，2006，34（15）：3625-3628）] 6）cDNA微阵列

建立一套统一且具有高质量、高代表性的cDNA列阵膜，在这一列阵膜上每个cDNA克隆都有固定的位置和编号，这样大大方便了数据的综合比较分析，并可对每个cDNA克隆子进行定量分析。在列阵杂交的基础上，还可以进行杂交测序，从而测定每个cDNA克隆子的序列。

2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？

主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。 优点：

? 简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。 ? 所需的mRNA量少。

? 各样本mRNA的差异可同时进行比较。

? 扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。 缺点：

? 假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 ? 工作量大。 ? 无法定量研究。

? 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。 利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221） 3、抑制性差减杂交的原理与应用。

原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂

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交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。 应用：

? 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达； ? 基因时空表达的研究：如根、茎、叶；

? 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。 4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。

A．酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域（DNA-binging domain,BD），一个是转录激活域(transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。

B．噬菌体表面展示技术原理：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。 5、T-DNA标签法克隆基因的一般技术路线。

? 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。 ? 建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.

? 用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。

? 用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。 ? 把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。 第七章 克隆基因的表达

1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。 大肠杆菌表达外源基因的优势：

?全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架； ?基因克隆表达系统成熟、完善；

?繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； ?被FDA批准为安全的基因工程受体生物。 大肠杆菌表达外源基因的劣势：

?缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； ?缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；

?内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白； ?周质内含有种类繁多的内毒素。 甲醇酵母表达系统的优点：

? 具有强的受严格调控的AOX1启动子 ? 表达蛋白的翻译后的加工和修饰 ? 营养要求低，工业化生产成本低 ? 可高密度发酵

? 表达蛋白可存在于胞内和胞外

酵母表达系统的缺点：酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题（这个找不到，百度的） 2、如何提高克隆基因的表达水平？

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1）、表达载体的优化设计； 2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性； 3）、密码子偏爱性； 4）、表达环境条件的优化。

3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？ 表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白

4、启动子从转录模式上可分为哪两种？表达系统常选用哪一种？其机理是什么？ 启动子从转录模式上分为：组成型启动子和诱导型启动子 表达系统常选用诱导型启动子 机理：指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。

5、 表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？ 表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；

多克隆位点

克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点 6、 根据表达蛋白用途的不同，设计选择基因的表达策略。

（1）表达蛋白用于生物化学和分子生物学研究 ——主要考虑保持蛋白质原有的功能不变；表达策略：融合表达和直接表达

（2）表达蛋白用作抗原——主要考虑表达蛋白的快速提纯；表达策略：以包涵体形式合成目的蛋白和融合表达目标蛋白（不用去除标签蛋白）

（3）表达蛋白用作结构研究——表达蛋白以天然可溶形式产生；表达时考虑因素：表达温度（高温促进包涵体的形成）；表达水平（高表达促成包涵体的形成）；表达载体受体菌。

第八章 植物基因工程

1、什么叫转基因植物？植物转基因技术的基本路线主要包括哪些？

利用DNA重组技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达的植物。

植物转基因技术的基本路线

? 分离目的基因

? 目的基因与恰当的载体DNA形成重组DNA ? 重组DNA的扩增

? 目的基因导入到受体细胞

? 筛选转化细胞，诱导产生转基因植株 ? 转基因植株的大规模种植

2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？

? 物理方法：电击法、基因枪法(biolistic)、显微注射法、微激光束法 ? 化学方法：PEG介导法、脂质体介导法 ? 生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法

3、运用已学的知识，如何全面分析获得的转基因个体（提示：包括外源基因是否整合，被插入位点分析，外源基因是否表达，表达量如何？等）

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对转基因个体进行检测与鉴定的对象 ——报告基因 ——目的基因

(1)基因组水平的检测与鉴定（外源基因是否整合，被插入位点分析）：可以用PCR扩增结合Southern Blotting进行验证。

(2)基因的转录/表达水平的检测与鉴定(外源基因是否表达):可用RT-PCR法或者Northern Blotting。

(3)基因的翻译水平的检测与鉴定（表达量）：可用Western Blotting或者ELISA。对报告基因来讲，还可以利用报告基因的显色或发光特性进行选择与 鉴定 4、出现转基因沉默现象的可能原因分析。

(1)位置效应：指插入部位及其周围序列对外源基因的影响 (2)DNA甲基化：包括编码序列和启动子的甲基化

(3)重复序列诱发基因沉默：多拷贝串联重复序列易引起外源基因的失活； (4)共抑制（co-suppression）：具有部分同源性的外源基因和植物内源基因相互作用引起的沉默现象。

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