植物生理 - 图文

植物生理实验技能训练教程

分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。3%磺基水杨酸水溶液；甲苯；

2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效；

脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。 四、训练内容

（一）恒温水浴锅的使用

电热恒温水浴用于恒温加热和蒸发，最高工作温度为 100 ℃，此仪器利用控温器控制温度，所以工作原理和使用方法与恒温箱相似。但应注意使用前在水浴槽内加足量的水以避免电热管烧坏。如较长时间不使用，必须放尽水槽内的全部水。 （二）751分光光度计的使用 2.1操作方法

①检查电源电压是否与仪器所要求的电压相符，然后再插上电源插头。

②根据测定所要求的波长选择光源灯。在波长 320 ～ 1 000nm 范围内用钨灯。在波长 200 ～ 320nm 范围内，用氢弧灯作为光源。拨动光源选择杆使所需要的光源灯进入光路。根据需要可以把滤光片推入光路，以减少杂散光，但通常情况下没有这种必要。把波长刻度旋到所要的波长上。

③检查仪器的各种开关和旋钮使处于关闭位置。然后再打开电源开关，使仪器预热 20 分钟。 ④选择适当波长的光电管。如测定的波长在 200 ～ 625 nm 范围内，用紫敏光电管，此时应将手柄推入。如测定的波长在 625 ～ 1 000 nm 范围，用红敏光电管，应将手柄拉出。 ⑤根据波长选择比色皿。测定的波长在 350 nm 以上时，用玻璃比色皿。测定波长在 350 nm 以下时，则需用石英比色皿。在比色皿中装好溶液，放在暗箱内的托架上，然后把暗箱盖好。 ⑥把选择开关拨到“校正”位置上。调节暗电流使电表指针指到“ 0 ”。为了得到较高的准确度，每测量一次都应校正一次暗电流。

⑦在一般情况下，旋转灵敏度旋钮从左边停止位置顺时针转动三圈左右。

⑧旋转读数钮，使刻度盘位于透光率 100 ％位置上。把选择开关拨到“3 1 ”处，然后拉开暗电流闸门，使单色光进入光电管。

⑨调节狭缝，使电表指针接近零位。而后再用灵敏度旋钮细致调节，使电表指针正确地指在“ 0 ”上。

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⑩ 把比色皿定位装置的拉杆轻轻地拉出一格（注意应使滑板处在定位槽中），使试样溶液进入光路，这时电表指针偏离零位。

⑾ 转动读数电位器旋钮，重新使电表指针移到“ 0 ”位上，此时刻度盘上的读数即为试样的透光率和相应的光吸收值。

⑿ 取得读数后，应即时将暗电流闸门重新关上，以保护光电管，防止受光时间过长而疲劳。 ⒀ 在读取透光率和相应消光值的数值时，若选择开关在“3 1 ”处，透光率范围为 0 ％～ 100 ％，相应消光值范围由∞～ 0 。当透光率小于 10 ％时，则可把选择开关拨到“3 0.1 ”位置，此时所读取的透光率数值，应以 10 除之。而所读出的消光值应加上 1.0 。 ⒁ 需要用同一标准溶液测定几个样品时，可重复以上的操作。

⒂ 测定完后，应把各个旋钮和开关复原和关闭，拔下插销，并把仪器罩好。 2.2注意事项

①在电压变动较大的地方，应使用稳压器，以确保仪器稳定工作。 ②其他见 721 型分光光度计注意事项。 （三）离心机的使用

离心机是利用离心力把比重不同的固体或液体分开的装置。离心技术广泛应用于工业、农业、医药、生物等科学研究领域中。根据转速的不同，可分为低速、高速和超速等不同类型。生理生化实验室经常使用的是低速电动离心机，它们的最高转速是 4 000 r ／ min 。 3.1 使用方法

3.1.1检查离心机调速旋钮是否处在零位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。 3.1.2离心前，先将离心的物质转移入合适的离心管中，其量以距离心管口1～2cm为宜，以免在离心时甩出。将离心管放入外套管中，在外套管与离心管间注入缓冲水，使离心管不易破损。

3.1.3取一对外套管（内已有离心管）放在台秤上平衡。如不平衡，可调整缓冲用水或离心物质的量。将平衡好的套管放在离心机十字转头的对称位置上。把不用的套管取出，并盖好离心机盖。

3.1.4接通电源，开启开关。

3.1.5平稳、缓慢地移动调速手柄（约需 1 — 2 分钟）至所需转速，待转速稳定后再开始计时。

3.1.6离心完毕，将手柄慢慢地调回零位。关闭开关。切断电源。 3.1.7待离心机自行停止转动后，才可打开机盖，取出离心样品。

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3.1.8将外套管、橡胶垫冲洗干净，倒置干燥备用。 3.2 注意事项

3.2.1离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上 3.2.2离心机应接地线，以确保安全。不允许倾斜。

3.2.3离心机启动后，如有不正常的噪音及振动时，可能离心管破碎或相对位置上的两管重量不平衡，应立即关机处理。

3.2.4须平稳、缓慢增减转速。关闭电源后，要等候离心机自动停止。不允许用手或其他物件迫使离心机停转。

3.2.5一年检查一次电动机的电刷及轴承磨损情况，必要时更换电刷或轴承。注意电刷型号必须相同。更换时要清洗刷盒及整流子表面污物。新电刷要自由落入刷盒内。要求电刷与整流子外圆吻合。轴承缺油或有污物时，应清洗加油，轴承采用二硫化钼锂基脂润滑。加量一般为轴承空隙的 1/2 。

（四）植物体内游离脯氨酸含量测定技术 1．标准曲线制作

表6-1 各试管中试剂加入量

管 号 标准脯氨酸量(ml) H2O(ml) 冰乙酸(ml) 显色液(ml) 脯氨酸含量(μg) （1）取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。

（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。 2．样品测定

（1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 （2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。

0 0 2 2 3 0 1 0.2 1.8 2 3 2 2 0.4 1.6 2 3 4 3 0.8 1.2 2 3 8 4 1.2 0.8 2 3 12 5 1.6 0.4 2 3 16 6 2.0 0 2 3 20 38

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（3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。

C?Va脯氨酸（μg/g FW或DW）=W

式中 C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得；

V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取的体积（ml）； W—样品重（g）。

五、思考题

1.植物体内游离脯氨酸测定有何意义？

2.当改变萃取剂时，比色应做哪些改变？如何选择最适波长？如何选择最佳萃取剂？

实训七 可溶性糖测定技能训练——蒽酮比色法

一、实训目的

1.了解测定植物组织中糖含量的几种方法。 2.掌握测定可溶性糖含量的原理和方法。 二、实验原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内,颜色深浅与糖含量成正比，故可用于糖的定量。

该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的末溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。

糖与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。

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