寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列
首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变
切割率% 酶 Acc I 寡核苷酸序列 GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 链长 2 hr 20 hr 8 10 12 8 12 0 0 0 0 >90 0 0 0 0 >90 Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 10 >90 >90 Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 >90 >90 10 >90 >90 12 8 12 >90 >90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 50 >90 >90 >90 10 >90 >90
BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 12 8 12 8 10 12 9 22 27 8 8 12 10 >90 0 25 0 0 50 0 0 25 0 0 50 25 >90 0 >90 0 0 >90 10 0 50 >90 0 0 50 10 >90 >90 Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 10 75 >90 BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA BstE II BstX I GGGT(A/T)ACCC AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 24 25 Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 10 >90 >90 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 >90 >90 10 >90 >90 12 >90 >90 Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 >90 >90 10 >90 >90 12 8 10 12 8 12 8 10 8 14 >90 0 0 10 0 >90 0 25 0 50 >90 0 0 75 0 >90 0 50 0 75 Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 10 >90 >90 Mlu I Nco I GACGCGTC CGACGCGTCG CCCATGGG CATGCCATGGCATG
Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 22 8 12 12 0 0 0 0 75 0 10 0 0 0 0 0 >90 0 25 50 0 10 10 90 >90 20 75 >90 Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 10 10 Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 16 10 20 10 24 25 28 25 Nsi I Pac I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 12 10 >90 22 8 10 12 8 10 12 24 8 >90 0 0 0 0 0 0 75 0 >90 0 25 >90 0 25 50 >90 0 10 Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 14 10 22 >90 >90 24 >90 >90 26 8 12 8 8 12 28 0 0 0 10 0 50 0 10 0 0 25 10 10 0 >90 0 50 75 Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 10 10 Sac I Sac II Sal I CGAGCTCG GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG 30 10 ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 32
Sca I Sma I GAGTACTC AAAAGTACTTTT CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 12 6 8 12 8 12 14 8 12 14 10 75 0 0 >90 25 75 10 10 50 >90 10 10 Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 10 >90 0 0 0 0 10 50 50 0 25 50 10 10 >90 Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 >90 >90 10 >90 >90 12 8 >90 0 >90 0 Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 10 >90 >90 12 75 >90 14 8 12 8 75 0 10 0 >90 0 25 75 0 75 >90 Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 10 10 Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 10 25 14 >90 12 50 >90 DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列
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