二、名词：
1、看护培养法(nurse culture)：是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
2、平板培养法(plante culture)：是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。
3、细胞悬浮培养（suspension culture）： 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
4、初始植板密度（inital planting density）：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
5、临界密度(critical density)：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。（课件没有） 6、植物细胞培养（plant cell culture）：是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团）进行离体培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
7、条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。 8、植板率：是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数
三、问答题：
1、如何得到单细胞无性系？
在细胞培养中，常由分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单细胞，也可以用机械法和酶解法从植物器官直接制备单细胞。
由分离的单细胞经看护培养法、微室培养法或平板培养法，即可得到单细胞无性系 2、单细胞培养有哪些方法？各有何含义及特点
单细胞培养：看护培养；微室培养；平板培养
（1） 看护培养法：指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖
的方法。
特点：优点：①简便易行。②效果好，易于成功。
缺点：①不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 用途：诱导形成单细胞系。
（2）微室培养：即将细胞培养在很少量的培养基中。
特点：优点： 在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程
缺点：培养时间较短
用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。
（3）平板培养法：把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底
上的培养方法。
特点：优点：①可以定点观察；②分离单细胞系容易； 缺点：培养细胞气体交换不畅。
用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 3、什么是植板率？小细胞团的计数方法有哪几种？
植板率是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数。 小细胞团计数方法：①低倍显微镜直接计算； ②细胞团显影法
4、什么是细胞悬浮培养？简述成批培养和连续培养的的特点？
细胞悬浮培养：是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。 （1）成批培养的特点：
①细胞生长在固定体积的培养基上，直至养分耗尽 ②用搅拌的方法使细胞团和细胞均匀分布
③细胞数目呈现慢—快—慢—停止生长的变化，但必须更换新鲜培养基才能进行下一批培养
（2）连续培养的特点：
①由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象
②可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快 ③适于大规模工业化生产 5、影响单细胞培养的因子
? 1、条件培养基：条件培养基可有利于单细胞的生长与分裂
? 2、细胞密度(>临界密度)：临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养
细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。
初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。
? 3、生长激素：生长激素加1种细胞分裂素和几种氨基酸(如：丙氨酸、谷氨酸、半
胱氨酸、谷氨酰胺)。临界密度只需25-30细胞/毫升。 ? 4、pH：偏酸。
? 5、CO2：可诱导细胞分裂。 6、细胞悬浮培养主要应用
1）、 植物有用物质的生产：在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物。
2）、诱发和筛选突变体：在细胞培养过程中会产生一些突变体，常采用不同培养基来进行选择，也就是把悬浮细胞培养于缺少某种营养物质或生长因子，或是添加某种抑制剂的培养基里，使突变细胞和正常细胞区别开来
3）、原生质体培养和细胞分离：利用细胞悬浮培养方法，对细胞原生质进行分离，在适宜的培养基上进行培养，使之生成完整植株，或对原生体的生理特性进行观察、研究。
4）、食品生产：通过对许多食用植物培养组织的细胞团生产的研究。 7、平板培养的基本技术
（1）单细胞悬浮液的制备 (2)悬浮细胞密度的调制
（3）琼脂培养基配制:0.7 % 琼脂条件培养基。 （4）平板制作 （5) 培养
《原生质体培养和细胞融合》复习题及参考答案
一、填空：
1、原生质体的分离方法有机械分离法和酶法分离法。 2、原生质体培养基常用的渗透剂是甘露醇和山梨醇。
3、原生质体的纯化方法有：沉降法、漂浮法和界面法。 4、原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。
5、原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养
6、原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；高pH高钙离子法；PEG法；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术
7、杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种细胞法；双荧光标记选择法 8、杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察；DNA内切图谱分析；同工酶分析
二、名词解释：
1、原生质体融合(protoplast fusion)：也称体细胞杂交（somatic hybridization），就是使分离下来的不同亲本的原生质体，在离体条件下通过诱导发生的质膜融合进而细胞核融合，像性细胞受精作用那样互相融合成一体的现象。 2、原生质体（protoplast）：是指除去了细胞壁后的裸露的植物细胞。
三、问答题：
1、简述原生质体作为遗传操作和生理生化研究的材料有何特点？
（1）没有细胞壁，有利于体细胞融合、体细胞杂交、基因转移和单细胞培养。 （2）原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质。 2、酶法分离原生质体时使用的酶的种类有哪些？ （1）纤维素酶类 （2）半纤维素酶类 （3）果胶酶类 （4）崩溃酶
3、简述一步酶法分离原生质体的方法
一步分离法：把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理而分离出原生质体。处理温度25-30oC，处理的时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2-24h。 4、如何纯化分离的植物原生质体并鉴定其活力？ (1) 原生质体的纯化
①沉降法：应用原生质体的比重大于溶液的性质而使原生质体沉于底部。 ②漂浮法：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。
③梯度离心法：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。
(2) 原生质体活力的测定
①形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。
②染色识别
1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。
2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 5、原生质体培养的方法有哪些？ （1）液体浅层培养 （2）平板法培养 （3）微悬滴法培养 （4）双层培养法
（5）饲养层培养
6、原生质体融合有哪几种主要方法？ （1）化学法诱导融合；（2）高PH-高钙离子法；（3）PEG法；（4）PEG结合高钙-高pH诱导法；（3）电融合技术 7、原生质体培养的意义 8、酶的种类及特点。
? 纤维素酶类（Cellulase）：纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂 ，可降
解纤维素，得到裸露的原生质体 。 ? 果胶酶类（Pectolyase）：果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细
胞从组织内分离出来 。
? 半纤维素酶类（Hemicellulase）：降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。 ? 崩溃酶：一种粗制酶。
? 蜗牛酶：主要用于分离小孢子（花粉母细胞和四分体细胞）的原生质体
《植物离体快繁和人工种子》复习题及参考答案
一、填空：
1、原球茎发生型是兰科植物特有的一种快繁方式。
2、离体快繁商业化生产应注意的问题是快繁苗的污染、玻璃化、褐化和黄化。
3、根据繁殖体的类型人工种子可分为两类：一类是体细胞胚人工种子；另一类是非体细胞胚人工种子。
4、人工种子包裹方法离子交换法；干燥法；冷却法。
二、名词解释：
1、离体繁殖（in vitro propagation)：微型繁殖（micropropagation)，指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。是工厂化育苗的技术基础。
2、人工种子(artificial seeds)：亦称体细胞种子，任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。 三、问答题：
1、植物快繁的器官再生主要类型？
短枝发生型；丛生芽发生型；不定芽发生型；胚状体发生型；原球茎发生型 2、植物快繁的程序。
（1）无菌（或初代）培养的建立 （2）繁殖体增殖 （3）芽苗生根
（4）小植株的移栽驯化 3、人工种子的优点。
（1）使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能快速繁殖和保存； （2）繁殖速度快；
（3）为基因工程技术应用于生产提供桥梁； （4）固定杂种优势； （5）提高植物抗逆性；
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