PCR技术综述

PCR技术综述

摘要：PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶链式反应，是一种通过体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。本文主要针对PCR的概念，原理和方法，简要介绍常用的PCR相关技术及其原理，方法及应用。

关键词：PCR；原理；应用及展望

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由变性、退火及延伸等反应构成一个周期，可循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有高特异性、高度灵敏性、高丰产量等特点，此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域都被广泛应用。 1、 PCR技术发展史

上个世纪60年代末，人们开始致力于基因体外分离技术的研究，但由于核酸含量较少，大大限制了DNA的体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增的设想，DNA经变性之后与合适的引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，不断重复该过程就可以克隆出tRNA基因。但是，由于当时的基因序列分析方法不是很成熟，热稳定性较强的DNA聚合酶也还没有发现，相关引物的合成处在手工合成阶段，所以这种想法没有什么实际意义。

1985年，美国科学家KaryMullis在高速路的启发下，经过两年努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供了合适的条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶和合适的缓冲体系。自此，PCR技术得到了生命科学界的一致认可，KaryMullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。然而，最开始的PCR技术还很不成熟，在那个时候是一种操作复杂、成本高昂的实验室技术。直到Saiki等人从一种嗜热杆菌提取到一种耐热DNA聚合酶，才使得PCR的扩增效率得以提高，PCR技术也开始得到广泛应用，成为遗传与分子生物学分析的根本基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：从定性发展到定量；从原先只能扩增几个kb到目前已能扩增几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。 2、PCR技术原理

基本PCR条件：1、DNA模板(Template)，2、引物(Primers)，3、DNA聚合酶(Polymearse)，4、合成的原料及水。

PCR的反应包括三个主要步骤，分别是：Denaturation、Annealing，andExtension。Denaturing即将DNA加热变性转为单链DNA作为复制的模板；而Annealing则是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端，最后在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长(Extensionofprimers)及另一条链的合成。

PCR反应步骤简单，但是具体操作复杂，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，避免假阴性或假阳性等情况的产生。 3、PCR技术的分类

3．1实时荧光定量PCR技术（real-timePCR）

学者经研究在1996年首创了实时荧光PCR技术，现已应用于医学、分子生物学和其他基础研究领域。该技术基于传统技术的优势，同时具有实时性、准确性、无污染，还实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃。

荧光定量PCR技术的最大特点是将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助荧光信号的累积，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知样品进行定量分析。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪就可以收集一个荧光信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化，这样就可以得到一条荧光扩增曲线。

3．2多重PCR技术（mutiplexPCR）

多重PCR技术，即在同一管中加入多对特异性引物，与管内的多个模板反应，可同时检测多个目标DNA。多重PCR可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中，进行多个位点的特异性扩增时，引物之间的配对以及引物间的竞争性扩增等都会对扩增产生影响。若能选择适宜的反应体系和反应条件，就可极大地提高多重PCR的扩增效果，比如退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。 3．3单分子PCR技术（SM-PCR）

单分子PCR技术与传统PCR技术相比，其基本循环过程是一样的，但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择和引物设计方面有不同，是以少量或单个DNA分子为模板的PCR。

在单分子PCR技术反应中，DNA模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量，这也是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应严格控制Gc含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。（在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物。）由于单分子PCR反应的变性温度（96-98℃）比常规PCR（94℃）略高，因而对DNA聚合酶热稳定性的要求也更严格，需要较好的热稳定性。其变性时间（5-15s）、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术。 3．4数字PCR技术（digitalPCR，dPCR）

最后要特别介绍的是数字PCR技术，它是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术，包括两部分内容——PCR扩增和荧光信号分析。

在PCR扩增阶段，数字PCR先将样品稀释到单分子水平，再平均分配到几十乃至几万个单元中进行反应。与定量分析PCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同，数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，有荧光信号标记为1，无标记为0，有荧光信号的反应单元中至少含一个拷贝。所以理论上，在样品中目标DNA浓度极低的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是，通常每个反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，就需要使用泊松概率分布函数进行计算，根据反应单元总数、有荧光信号单元数以及样品稀释系数，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。

数字PCR通过终点检测计算目标序列的拷贝数，不需要采用内参和标准曲线；此外，由于数字PCR采用终点检测，因此也不依赖于Ct值，受扩增效率的影响就大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力也大大提高，具有很高的准确度和重现性。而且在数字PCR标准反应体系分配的过程(稀释过程)能够极大的降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也适用于在复杂背景中检测稀有突变。 4、PCR技术的应用 4.1PCR在食品行业检测

PCR技术在食品行业主要用于微生物含量的检测。传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时，需经富集、分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴

定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。对肉制品的检验，蛋白质鉴定技术已经成功运用于鉴别生鲜肉类的品种，但当食品中的肉类经切碎、蒸煮、熏烤等加工后，失去了原有的形态学特征和质地，从而破坏物种特有的蛋白质和抗原决定部位。所以，蛋白质鉴定肉类品种的稳定性和可靠性较差，已不能满足现代肉类安全检测的要求。使用PCR技术建立检测清真食品中是否含有猪肉或猪油的方法，物种特异性PCR技术可以用于清真食品的鉴定，是一种可以信赖和合适的技术。 4.2PCR在医学中的应用

在临床医学方面也经常使用PCR技术，如对乙肝病毒、肿瘤等的检测。PCR技术在肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已经取得了可喜的成果。同时PCR技术也被用于多点突变遗传病的检测。PCR在法学中已应用于亲子鉴定，血型鉴别以及指纹鉴别等。如对血迹，无法用传统血清学的方法进行血型检验时，就可采用PCR方法检验ABO和MN血型。 4.2.1PCR在肿瘤诊断上的应用

遗传学改变主要是引起癌基因激活和抑癌基因失活，使基因发生突变、缺失、增加和易位等而导致了细胞癌变。PCR不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期及预后评估等。目前用于肿瘤检测的PCR主要有定量RT-PCR，它在肿瘤诊断、治疗等方面具有广泛的应用价值。 4.2.2PCR在遗传病诊断上的应用

十几年来，该技术在遗传病诊断的临床应用方面获得了极大的成功，如地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆性x综合症、苯丙酮尿症、Turner综合征等这些遗传病都可以通过PCR技术进行扩增，然后利用基因分析直接检测出突变位点。

4.2.3PCR在感染性疾病方面的应用

目前PCR在医学检验中对感染性疾病的诊断极具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以检测到任何有限的病原体，从而判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。 4.3PCR在应用水中的检测

1990年，Bejetal在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。而对于水中得而大部分细菌，通常采用分离培养来鉴定它们弄得种类和数量，但是分离方法和培养基的选项额是限制检测效率的问题所在，使得一部分细菌由于不能在人工培养基上生长，使得鉴定的细菌种类和数量低于环境中的实际值。因此运用PCR技术可对水体进行直接检测，缩短检测时间，扩大检测范围，并且具有较高的精确度。同时也可以反映水环境中微生物病原体的种类及多样性。 4.4PCR技术在农业中的应用 4.4.1PCR在转基因产品检测中的应用