使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案

使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案

虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。 使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案

动物学研究。2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。

图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。（改编自 Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。2014 年 8 月；9(8):1956-68.）

Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和

CRISPR/cas9。默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX?名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。

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成功的小鼠模型项目的提示

1.了解实验目的并开展研究。

生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。了解这一假设将有助于团队选择合适的小鼠品系，并设计合适的靶向载体和生物对照。仔细阅读文献和所有小鼠遗传学信息学数据库，以确定是否已经存在合适的小鼠模型，如果是，是否可以从创作者处获得这些小鼠。

2.确定基因表达变化应该发生的空间和时间环境。

根据正在测试的假设，确定基因修饰是否应该由组织特异性、谱系特异性或诱导型启动子控制。一些转基因或基因敲除可能对胚胎是致死性的；这些情况下就需要诱导型启动子。 3.选择合适的小鼠品系。

近交系小鼠的每一个品系都具有显著的特性，可能特别适合于特定的研究领域。例如，BALB/c 小鼠适用于免疫学研究，但由于固有的神经发育缺陷，可能不适合生成神经系统疾病模型。NOD 小鼠适用于自身免疫和代谢综合征模型，但由于其寿命短，用于衰老研究的效用有限。

4.使用特征明确的启动子，并在构建体中设计限制性位点，以便选择删除抑制转基因表达的载体序列。

如果表达一个外源基因，理想的情况下，靶向载体应该包括一个以前用于生成转基因小鼠的启动子。另外，尝试确定载体序列是否可能抑制表达。始终在相关的细胞类型的培养物中测试构建体以确认表达。

5.包括强聚腺苷酸化序列（如 SV40 聚腺苷酸化序列）。

在构建体中包含一个内含子序列，这样转录物就会被拼接。因为拼接机制可能介导转录——翻译偶联，所以通过包含内含子可以增强基因表达。 6.优化同源重组率。

增加靶向构建体中同源区的长度可能会增加重组率。你的目标染色质结构可能影响重组频率，以及遗传背景。

7.如需转染 ES 细胞，使用高效转染试剂。

尝试多种转染试剂或方法，以确定哪种方法生成转染ES细胞克隆的效率最高、毒性最低。

8.建立筛选试验，如PCR试验或Southern blot。

理想情况下，你的筛选试验应使用探针或带有不存在于未修饰的细胞中的序列的引物. 9.开发用于基因表达的检测体系。

蛋白检测体系包括Western Blot、ELISA、Luminex?检测、免疫组织化学、流式细胞检测或RT-PCR。

10.制定可靠的基因分型策略。

使用尾部活组织检查或耳组织，制定快速方案，使用 PCR分离基因组 DNA 和评估基因型。一些 DNA 聚合酶，如KOD Xtreme? DNA聚合酶，特别适用于基因分型，因为它们可以准确高效地扩增粗制样品中的DNA，如尾部消化物。对于这样的聚合酶，在 PCR 反应中加入 1 μL 或更少的消化物之前，可能不需要纯化尾部消化物。尾部活检经常产生大量的 DNA；如果 PCR 结果没有可见条带，可能是模板序列过多与引物浓度相比抑制了扩增。

11.遵循培育转基因小鼠的最佳实践以保存种畜。

维持改良小鼠供给所需的繁殖配对的数量和特征取决于许多因素。其中一些因素包括菌株特异性行为、特定突变或转基因的影响、菌落温度和湿度、光源和光周期、振动、噪音、气味、处理、营养、气压和整体健康。

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材料

货号

产品描述

A4718琼脂糖for molecular biology

CAS9PCas9 质粒

C8554绒毛膜促性腺激素 人lyophilized powder, suitable for mouse embryo cell culture

DNTP10脱氧核苷酸组，10mMIndividual dNTPs for routine PCR; 0.5 mL each E6758乙二胺四乙酸anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture

NA2020GenElute? 血液基因组DNA试剂盒sufficient for 350 purifications

NA0200GenElute? HP质粒中量制备试剂盒sufficient for 25 purifications

RTN70GenElute?哺乳动物总RNA小量制备试剂盒sufficient for 70 purifications

NA1020GenElute? PCR 纯化试剂盒sufficient for 70 purifications

货号 产品描述

透明质酸酶 来源于牛睾丸Type IV-S, powder, suitable for mouse embryo cell culture, 750-3000 units/mg solid KOD热启动DNA聚合酶High fidelity DNA polymerase designed for

71086accurate PCR amplification of long strand and GC- rich DNA templates

for cloning and cDNA amplification applications. KOD Xtreme Hot Start DNA PolymeraseUltra high fidelity

71975-dnapolymerase designed for the most challenging PCR applications Mincluding: crude sample PCR, amplification of long strand and highly GC- rich DNA templates. H4272M7292M16 培养基With sodium bicarbonate and lactic acid, without penicillin

and streptomycin, liquid, sterile-filtered

M2 培养基With HEPES, without penicillin and streptomycin, liquid, sterile-filtered, suitable for mouse embryo cell culture

M7167

M8787氯化镁 溶液PCR Reagent, 25 mM MgCI2 solution for PCR

M8410矿物油light oil, BioReagent, suitable for mouse embryo cell culture

P231710X PCR缓冲液，不含MgCl2Optimized for routine PCR without MgCl2 苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1，10mM Tris饱和溶液，pH8.0，1mM EDTAfor molecular biology

P3803T8280TRIS醋酸盐-EDTA缓冲液BioReagent, 10× concentrate, for molecular

biology, DNase and RNase, none detected, powder blend, suitable for electrophoresis Trizma ? 碱BioPerformance Certified, meets EP, USP testing specifications, suitable for cell culture, ≥99.9% (titration)

T6066