因而，有时一种色谱体系或类型常有几种不同的名称。 4.2.1 按固定相及流动相的物理状态分类
色谱分析中总是存在着两个相——流动相和固定相。按照流动相的状态，色谱可以分为以下类型。
（1）液相色谱法（LC） 流动相是液体，而固定相可以是固定在适当的固相载体上，或是与流动相不相溶或部分混溶的其他液体。以此为基础，液相色谱法又可以进一步分为液-固色谱法和液-液色谱法两类。
（2）气相色谱法（GC） 流动相是载气，而固定相可以是固体物质，也可以是一种不易挥发的液体，称为固定液，该固定液必须固定在适当的固体载体上。气相色谱法也可以分为两小类，即气-固色谱法和气-液色谱法。
（3）超临界流体色谱（SFC） 还有一种色谱即超临界流体色谱，与上述的液相色谱和气相色谱不同，其流动相不是一般的气体或者液体，而是采用超临界流体。超临界流体的密度比一般气体大得多，而与液体相似，具有不同于一般气体和液体的特性及独特的分离性能，固亦可称为高密度气相色谱法或高压气象色谱法。目前研究较多的是CO2超临界流体色谱。这种色谱方法能分析气相色谱法不能或难于分析的许多沸点高、热稳定性差的物质，而比液相色谱更容易获得高的柱效率。尽管已经证明SFC不能取代GC和HPLC，但它能从不同方面弥补二者的不足。
表5-1 按固定相及流动相的物态分类 流动相 气体 液体 总称 气相色谱 液相色谱 固定相 固体 液体 固体 液体 超临界流体 超临界色谱 固体 色谱名称 气-固色谱gas-solid chromatography，GSC 气-液色谱 gas-liquid chromatography，GLC 液-固色谱 liquid-solid chromatography，LSC 液-液色谱 liquid-liquid chromatography，LLC 超临界色谱 supercritical fluid chromatography，SFC 4.2.2 按分离过程的物理化学原理分类
按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为如下几类。
（1）分配色谱（partition chromatography）利用各个被分离组分在固定相和流动相两相之间分配系数的不同而进行的分离称为分配色谱。也可以说，分配色谱主要是根据物质在两相中的溶解度差异而实现分离。分配系数KD是固定相中一种组分的平衡浓度对流动相中同一物质的浓度之比，所以，各组分的分离效率与其分配系数的差值成正比。
在分配色谱法中，通常使用两相系统。用液体作固定相，利用试样组分（亦称为溶质）在固定相中溶解、吸收或吸着（sorption）能力差异，在两相间分配系数不同从而将组分分离，如气-液分配色谱、液-液分配色谱。在液-液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极性不同，又分为正相分配色谱和反相分配色谱。一般来说，以强极性、亲水性溶剂或水溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称为正相分配色谱（normal phase partition chromatography），简称正向色谱（NPC）。若以非极性、亲脂性物质为固定相，极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，则称为反相分配色谱（reversed phase partition chromatography），简称反相色谱（RPC）。正相色谱和反相色谱的概念，现已推广应用到其他类型的液相色谱。
如果将一种非挥发性液体固定在适当的固体载体上，那么分配色谱法也可以在气相和非挥发性液相之间进行。液相中被分离组分溶解度的差异两次得到利用，溶解度较小或挥发
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的组分在一定温度下由载气迅速带走，从而使各个组分得到分离。
（2）吸附色谱（adsorption chromatography） 由于物质对活性固体（或液体）表面吸附力具有差异，使混合物中不同组分在固体（或液体）界面上呈现出浓度变化，发生某些组分的浓缩，这种现象称为吸附。对于各组分来说，吸附系数的差异决定于相界面上浓度的差异。若两相之间做相对移动，则这种差异就表现为色谱分离。所以，吸附色谱是以固体或液体吸附剂作固定相的气相色谱或液相色谱，它利用组分在吸附剂上吸附力的不同，因吸附平衡常数不同而将组分分离。
吸附的亲和力主要取决于物质的极性大小等因素。有机化合物分子中的官能团与非极性的碳链相比，对吸附色谱的分离效果有更大的影响。吸附色谱适宜于把混合物中的物质按其所含的极性基的数目和类型进行分类。
（3）离子交换色谱（ion-exchange chromatography） 如果被分离的各组分在溶液中形成离子，那么这些离子就与溶液中离子交换剂的解离基团发生静电作用，这种静电的相互作用就是离子交换。液相色谱中利用这种离子交换原理而进行分离的色谱，称为离子交换色谱。这是用离子交换剂为固定相，分离离子型化合物的色谱方法。
通常，带电荷多的离子对交换剂的亲和力大于带电荷少的离子。被分离混合物中各组分的离子交换能力，将取决于各组分电荷的差异。解离组分的平均电荷与离子电荷、基团的解离常数以及介质的pH值有关，同时还取决于溶液中的离子浓度。
在离子交换色谱中固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，带有固定正电荷的称为阳离子交换树脂。固定电荷吸引相反符号的对立离子以保持中性。
（4）凝胶色谱（排阻色谱）（gel chromatography） 空间排阻色谱（又称排斥色谱）与其他色谱机理不同，它近似于分子筛效应。空间排阻色谱的色谱柱内填充以凝胶，凝胶内具有一定大小的孔穴。样品进入色谱柱后，随流动相在外部间隙以及凝胶孔穴旁流过。体积大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而排阻，因此较早的被冲洗出来；中等体积的分子产生部分渗透作用；小分子可渗透到孔穴里去，因有一个平衡过程而较晚地被冲洗出来。这样，样品分子基本上是按其分子大小排阻先后由柱中流出，从而达到分离。对同系物来说，洗脱体积是分子量的函数。洗脱次序将取决于分子量大小。分子量大的先流出色谱柱，分子小的后流出。
空间排阻色谱法也叫凝胶渗透法或凝胶过滤法。这种方法在50年前便开始应用，当葡聚糖凝胶出现以后，由于可以测量较广范围内分子量的分布，因此受到很大重视。最初，流动相主要使用水溶液，所以采用凝胶过滤这一名词。后来可以用非水溶剂，亦称用凝胶渗透过滤。两者的分离机理没有任何区别。确切地说，应该将此法称做空间排阻色谱，或称排斥色谱。
（5）亲和色谱（affinity chromatography） 前几种色谱的原理是建立在被分离物质对固定相“亲和力”的差异上，而亲和色谱中的“亲和力”是建立在生物化学过程中，被分离物质与具有特异性质的配基相互作用的基础上。这种特异的相互作用产生在具有高选择性反应的一对物质之间，例如，抗体和抗原彼此特意地结合在一起，酶与其底物起反应，而不与其他物质作用等。如果上述一对物质中的一种以共价键的方式键合在一种适当的载体上，而又不丧失其功能，那么它就可以从溶液中选择性地结合与其配成对的另一物质。如果把这种制剂装入色谱柱中，使溶液以慢速通过，则所需组分被结合而保留在柱中。柱子再经洗涤解析之后就得到所分离的物质。亲和色谱中成对物质的结合具有专一性，同时是可逆的。 4.2.3 按固定相形状分类 （1）柱色谱（column chromatography） 固定相装在色谱柱内称为柱色谱。根据色谱柱的尺寸、结构和制备方法不同，又分为填充柱（packed column）色谱和毛细管柱（capillary column）或开管柱（open column）色谱。GC、HPLC均为柱色谱。
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（2）平板色谱（planar chromatography） 固定相呈平板状，当流动相流过时，样品组分在平板上展开，进行分离。平板色谱包括薄层色谱（thin layer chromatography）和纸色谱。当固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板或塑料板上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层色谱（TLC）。用滤纸做固定相或固定相载体的色谱，则称为纸色谱（PC）。
（3）纸色谱（又称纸上层析）是以纸为载体的液相色谱法，属于分配色谱的一种。它是借助滤纸作为支持物，用水饱和后构成固定相。当与固定相不相混溶的有机溶剂流动相通过固定相时，使被分离的各个组分连续地在两相之间动态分配，从而达到分离的一种操作。滤纸本身是惰性的，不参与分离组分的过程，只起负载水分的作用，分离由组分在流动相和纸上水分之间的分配不同所引起。因此在纸色谱中，组分在两相中的分配系数起主要作用。化合物在纸色谱上的位置用比移值Rf表示。
Rf=化合物移动距离／展开剂移动距离
Rf值随被分离化合物的结构、固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素而变化。当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值Rf就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。由于影响Rf值的因素很多，实验数据往往与文献记载不完全相同，因此在鉴定时常常采用标准样品作对照。此法一般用于多功能团或高极性化合物如糖、氨基酸等有机物质的微量（5～500mg）定性分析。 4.2.4 不同色谱方法的比较
纸色谱、薄层色谱、高效液相色谱以及气相色谱是四类广泛应用的色谱技术，它们各有优缺点及适用范围。纸色谱是几种色谱中最廉价的一种，但展开时间长，用来分离水溶性物质比较方便。薄层色谱的优点是设备和操作比较简单，展开时间快，应用范围及分析对象很广。无论是无机、有机、生化、药物等都可应用薄层色谱；从化合物的性质来看，小分子或大分子化合物，水溶性或非水溶性物质等各种类型物质的分离、精制、鉴定和定量都可用薄层色谱。
高效液相色谱在定量的精确性和稳定性等方面比薄层色谱更好，但设备和实验费用较高。气相色谱定量准确性高，但只适用于在设备柱温条件下（一般为200～300℃）能汽化的化合物，因此限制了它的应用范围。在有机化合物中大约只有20%～30%的产品适用，在实际应用中所占比例偏少，但仍具有液相色谱不可取代的优势。表5-2就不同色谱在设备、适用对象等方面的差异进行了比较。
表5-2 几种色谱方法的比较
项目 设备 分析对象 样品用量 检测灵敏度/g 检测方法 纸色谱 简单 水溶性物质 nμg 10 以物质的化学特性或物理特性为基础的显色剂、扫描法 160～480 -5薄层色谱 较简单 较广 nμg 10 -7高效液相色谱 复杂 较广 0.01～1μg 10～10 -8-12气相色谱 复杂 能汽化的高温稳定物质 0.01～1μg 10 -10以物质的化学特性紫外、可见荧热导池、氢或物理特性为基础光光谱、示差火焰 的显色剂、扫描法 折光、电化学 ＋ 2～5 20～100 ＋＋ 1 5～60 ＋＋ 1 5～60 定量准确度 定量重现性/%（体积分数） 展开及洗脱时间/min 23
4.3 薄层色谱
4.3.1 简介及一般原理
薄层色谱法（TLC）通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法，即将吸附剂在光洁的表面，如玻璃、金属或塑料等的表面上均匀地铺成薄层，而后按照与纸色谱相似的操作点上样品，以流动相展开。这样，组分不断地被吸附剂吸附，又被流动相溶解解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力，因此在流动相向前流动的过程中，不同组分移动不同距离，以实现分离。这种分离的机制是吸附力的强弱差别，所以一般的薄层色谱法属于吸附色谱法的范畴。一种物质在TLC上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称作该化合物的比移值，用Rf表示。即：
Rf=化合物移动距离／展开剂移动距离
当实验操作条件（如固定相、展开剂等）固定时，Rf是一个化合物的特有常数，故可利用它来鉴别有机化合物或作为监测反应进程的一种手段。TLC应用于分离提纯的操作，是将展开后的各个色带取下，用溶剂溶解各个色带的物质从而获得纯度高的产品，此时称之为制备薄层色谱。此外TLC也经常用于寻找柱色谱的最佳分离条件。
薄层色谱常用的固定相有硅胶或氧化铝。硅胶具有不同的型号，如硅胶H（不含粘合剂）、硅胶G（含煅石膏粘合剂）、硅胶GF254（既含燃石膏又含荧光剂）等类型。氧化铝也具有上述型号，且有中性、酸性、碱性之分，分别用于分离中性、酸性和碱性物质。用不含有粘合剂的硅胶制成的板叫软板，用含有粘合剂的硅肢制成的板叫硬板。实用中即使使用硅胶G，也要再加入羧甲基纤维素钠或淀粉粘合剂，以增强板的硬度。
硅胶、氧化铝吸附剂是极性化合物，它和化合物分子之间的作用力主要是范德华力和氢键，所以当展开剂的极性远远大于混合物中各组分的极性时，它将代替混合物中各个组分而被吸附，这样各组分只能保留在流动相中，此时Rf=1，达不到分离目的。相反，当展开剂极性远远低于混合物各组分极性时，Rf=1，也达不到分离的目的。所以在实际科研工作中，展开剂的选择是重要的一环。选择一个展开剂往往要经过多次实验进行对比，有时单一溶剂不行，可以采用不同比例的多组分混合溶剂。
为达到某些分离的目的，薄层色谱法有时也利用其它分离机制，如分配、离子交换、分子排阻等方法，这主要取决于所用的固定相。在进行分配分离时，要在铺好的薄层上均匀地再涂布一种做为固定泣的液体，此时铺层的材料最好不用吸附剂而改为惰性物质，如纤维索、酸藻土等，以免发生不必要的吸附作用而干扰分离。将铺层的材料改为离子交换剂或凝胶，即可进行离子交换薄层色谱或分子排阻色谱的分离，分别适用于离子化合物与大分子物质的分离。
4.3.2 实验装置与仪器
薄层色谱所使用的仪器是铺有硅胶或氧化铝固定相的玻璃板放在一个相应的展开器中构成，如图5-6。加盖的广口瓶也可用做展开槽。通常作定性分析所使用的玻璃板为7.5cm x 2.5cm或相近规格，而作为分离提纯使用的制备薄层色谱的玻璃板则根据实际情况确定，比如20cm x30 cm。
固定相或载体最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。 其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上, 后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7％)适量
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