用于抗体药物生产的动物细胞培养基研究进展

中国医药生物技术 2014年2月第9卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No.1 53

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.01.011

·综述·

用于抗体药物生产的动物细胞培养基 研究进展

段须杰，任彤，罗厚勇，刘睿，徐卫涛

近年来，具有靶向明确，副作用小等优势的抗体药物受到国内外药企的广泛关注。2012 年，抗体药物全球销售额已达 650 亿美元左右，并占据全球十大畅销药物的半壁江山[1]。

动物细胞大规模培养和抗体质量分析已然成为我国抗体药物产业化的主要限制因素[2]。培养基优化作为动物细胞大规模培养的关键环节，长期被国外生物技术公司（如 Thermo Fisher 公司、Sigma 公司等）、医药巨头所垄断。尽管目前国内抗体药物的表达水平有显著提高（1 ~ 2 g/L），但仍以使用商业培养基为主，缺乏自主知识产权的产品。由于对所使用的培养基成分未知，一旦出现抗体质量问题便无从优化，特别对于生物仿制药开发而言，抗体质量的一致性显得尤为重要。与此同时，使用商业化培养基还需承担较高的开发成本，往往是自主开发培养基成本的 5 ~ 10 倍。

众所周知，培养基开发工作与生产用细胞株特征关系密切，因此，在培养基开发过程中需要围绕生产用细胞株的特点进行“个性化培养基”的设计和优化。本文从抗体生产用动物细胞入手，重点关注近年来国际上关于动物细胞培养基开发的最新报告，以介绍 CHO 细胞和 NS0 细胞培养基为主，详细阐述培养基各类组分、功能以及开发策略，以期对国内药企进行培养基开发起到指导作用，并对未来培养基研发趋势进行展望。

CHO 细胞相比，NS0 细胞更倾向于凋亡，可能是由于营养此外，NS0 细物耗竭或者培养微环境产生的压力所造成[4]。

胞为胆固醇营养缺陷型，因此在培养过程中需要添加胆固醇以维持细胞正常生长。由于 NS0 细胞内源 GS 缺乏活性，因而常与 GS 筛选系统联用获得稳定高产的细胞株。

从表达抗体质量的角度来看，CHO 细胞生产的抗体与人类自身抗体更为接近，而采用 NS0 或 SP2/0 细胞所表达的抗体则会产生非人源的糖基化修饰，如 α(1,3)-半乳糖结构和 N-羟乙酰基神经氨酸（N-glycolyl neuraminic acid，NGNA）唾液酸结构，在人体内会产生免疫原性，因而近年来较为少用[3]。值得一提的是，CHO 细胞的内源性反转录病毒不易传播人类，而 NS0 细胞则可能产生传染性反转录病毒[4]。

除此之外，PER.C6 细胞作为一种新型的宿主细胞已用于表达抗体药物，并能够获得与人类更为接近的糖基化结构。但到目前为止，采用 PER.C6 细胞生产的多种候选抗体药物仍处于临床研究阶段。

2 培养基组分及功能

由于动物细胞对营养物质、培养环境的要求较为苛刻，培养基一般包括 60 ~ 80 种营养物质，某些培养基组分甚至超过 100 种。除此以外，不同种类的动物细胞对于培养基组分的要求也不尽相同，而且组分的改变也会对抗体的质量产生显著影响。因此，如何依据动物细胞种类，通过培养基优化以满足抗体产量和质量的“双重要求”成为抗体产业化过程中亟待解决的关键环节。

本文将以介绍 CHO 细胞和 NS0 细胞培养基为主，逐一阐述动物细胞培养基成分及其相应作用，为开发适合动物细胞的“个性化培养基”提供理论指导。 2.1 水

水是培养基的重要组分之一，却往往被研究人员所忽视，培养基用水品质的好坏将直接影响到细胞的生长状态。水中的污染物主要包括无机物、有机物、细菌产物（内毒素）、颗粒等。无机物包括重金属、铁、钙、氯等。有机物主要是植物腐败的副产物和洗涤剂。因此培养基用水必须经过高度 基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09105301） 作者单位：210042 南京，江苏先声药业有限公司 通讯作者：段须杰，Email：duanxujie@simcere.com 收稿日期：2013-07-26

1 生产用动物细胞概述

对于抗体药物而言，为了满足其生物活性，需要对蛋白质进行正确的折叠和翻译后修饰，因此用于抗体生产用宿主细胞以哺乳动物细胞为主。迄今为止，在已批准的抗体药物中，所使用的动物细胞主要包括 CHO 细胞、NS0 细胞和 SP2/0 细胞，其中 CHO 细胞作为生产用宿主细胞达到 50% 左右，NS0 细胞达到 20% 以上[3]。

CHO 细胞是 1957 年 Tjio 和 Puck 将原代培养的中国仓鼠卵巢细胞永生化获得的，包括 K1、DG44 和 DUXB11 三种。其中，DG44 和 DUXB11 细胞由于不具有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）活性，需要添加甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷才能正常生长。因此两者通常采用 DHFR 筛选系统获得生产用细胞株。而 CHOK1 则恰恰相反，常与谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）筛选系统联用。

NS0 细胞是由 Galfr 和 Milstein 于 1981 年获得的一株不合成分泌免疫球蛋白重链或轻链的鼠骨髓瘤细胞。与

54 中国医药生物技术 2014年2月第9卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No.1

纯化获得。一般而言，培养基采用注射用水或者采用同级别的超纯水进行配制。 2.2 碳水化合物

葡萄糖是培养基中最常使用的碳水化合物，用于提供能源。然而，葡萄糖代谢会产生对细胞生长和抗体合成重要影响的副产物——乳酸。通过控制葡萄糖浓度或者采用其他能源物质（如半乳糖、果糖等）可以降低培养过程中的乳酸产量，但可能会对抗体的糖基化类型产生影响，进而影响抗体在体内的生物活性[5-7]。此外，也有文献报道通过在培养基中添加丙酮酸代替谷氨酰胺作为能源物质，可以降低乳酸和氨的产量[8]。 2.3 氨基酸

构成生物体蛋白质的氨基酸约 20 种，大体可分为必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA），它们不仅用于合成蛋白质，同时还通过氨基酸代谢途径提供能源。由于不同种类的动物细胞甚至同一类别的不同克隆对于氨基酸的代谢情况都可能完全不同，因此，对于培养基中氨基酸的优化显得尤为重要，不但要保证各种氨基酸浓度的平衡，同时要避免因某种氨基酸消耗殆尽，导致细胞生长停止或者凋亡[9]。

谷氨酰胺作为重要的能源物质，同时还是嘌呤、嘧啶的合成前体，对于非 GS 表达系统的细胞（如 CHO-DHFR 细胞）生长十分重要，主要是由于细胞内源 GS 基因表达水平较低所致。而对于GS 表达系统的细胞（如 GS-CHO 和 GS-NS0）而言，谷氨酰胺则无需添加至培养基。除此以外，还应根据具体的细胞株特性来有选择地添加氨基酸，例如有些 CHO 细胞属于脯氨酸缺陷型，因此需将脯氨酸作为 EAA 添加至培养基中。 2.4 维生素

维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要的生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶。维生素分为水溶性和脂溶性两类。水溶性维生素主要指 B 族维生素，包、核黄素（B2）、烟酰胺（B3）、泛酸（钙）括硫胺素（B1）

、吡哆醇（醛）（B6）、生物素（B7）、叶酸（B9）和氰（B5）

。脂溶性维生素主要有维生素 A、维生素 D、钴胺素（B12）

维生素 E 和维生素 K。与脂溶性维生素相比，水溶性维生素能够更好维持细胞生长并保证较高的活率[10]。此外，维生素 C 或维生素 E 通常作为抗氧化剂添加至培养基中，但对细胞生长或者抗体合成影响较小2.5 无机盐及微量元素

培养基中的无机盐包括 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl–、HPO42–、H2PO4–、HCO3– 等。其中，Na+、K+ 和 Cl– 负责调节许多营养物质和大分子的跨膜运输；Mg2+ 是细胞间质的重要组分，同时还是酶反应的辅因子；Ca2+ 参与细胞生理活动，并调节细胞膜功能；HCO3– 主要起到 pH 缓冲作用。deZengotita 等

[12]

[11]

微量元素主要包含铁、铜、锌、硒、锰等。铁是一种必需元素，因为铁涉及众多参与 DNA 复制和细胞代谢的酶，铁缺陷会引起细胞周期停滞在 G0 或者 G1 期，甚至使快速分裂的细胞发生凋亡[13]。铜离子作为培养基中重要的氧化剂，对抗体质量（二硫键形成、C 末端降解、唾液酸含量等）、细胞代谢（细胞密度、乳酸含量等）都会产生重要在无蛋白培养基开发中影响[14-15]。锌作为胰岛素的替代物，

得到广泛应用[16]。硒元素则是谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，能够保护细胞不受活性氧的伤害[17]。锰元素作为一系列糖基转移酶重要辅因子，在抗体糖基化过程中起到关键作用，改变培养基中 Mn2+ 浓度可以显著影响抗体的糖基化特征[18]。 2.6 脂类及前体

脂类是细胞膜的重要组成部分。由于磷脂、脂肪酸和胆固醇共同影响细胞膜的流动性，氯化胆碱、肌醇、乙醇胺、油酸、亚油酸等物质常以脂类前体形式添加至培养基中用于合成细胞膜。与CHO 细胞不同，NS0 细胞通常为胆固醇缺陷型，因此在 NS0 细胞培养中常将胆固醇以脂类混合物的形式添加，但是脂类的添加有可能会改变蛋白的糖基化特征[19-20]。此外，Li 等[4]通过在培养过程中添加 5-氮杂胞苷使得 NS0 细胞成为胆固醇非依赖性细胞，抗体产量达到 4.5 g/L。 2.7 核苷

动物细胞一般可以通过从头合成途径合成核苷酸，因此一般情况下不需要在培养基中添加外源核酸类物质。但对于从头合成途径受阻的细胞（DHFR 缺陷型细胞）就必须添加补救途径的底物——次黄嘌呤和胸苷。Chen 等[21]研究发现每 5 mg/L 胸苷中添加 10 mg/L 次黄嘌呤能够显著促进 CHO 细胞生长。Carvalhal 等[22]在培养基中添加 1 mmol/L 腺嘌呤或鸟嘌呤会造成 CHO 细胞生长严重抑制，而相同浓度的尿嘧啶或胞嘧啶则对细胞生长没有影响。此外，核苷类物质的添加还可能对抗体的糖基化特征产生影响，因此在培养基优化时需特别注意[23]。 2.8 生长因子及转运蛋白

胰岛素和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）常添加至培养基中，两者均能够刺激葡萄糖利用，以及 RNA、蛋白质和磷脂的合成。Rouiller 等[24]通过添加糖皮质激素（氢化可的松）可以显著提高 CHO 细胞活率并提高蛋白产量，而 Jing 等[25]通过添加地塞米松在提高糖蛋白的唾液酸含量方面取得了成功。

转铁蛋白是一种常用的糖蛋白，能够结合铁，与铁向细胞的传递密切相关。由于转铁蛋白成本较高，人们逐渐采用铁螯合剂来代替转铁蛋白。Zhang 等[26]发现柠檬酸铁和亚硒酸钠的复合物能够有效地代替转铁蛋白。陈飞[27]认为在无血清培养基中没有柠檬酸铁存在时，即使添加高浓度的转铁蛋白也不能有效支持 CHO 细胞生长和抗体表达，也就是说柠檬酸铁在支持 CHO 细胞生长方面具有转铁蛋白不可替代的作用。

。

研究发现通过流加 NaH2PO4 可以显

著提高 GS-NS0 细胞密度，可能是由于磷元素是细胞磷脂、DNA 和 RNA 的重要组成部分。

中国医药生物技术 2014年2月第9卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No.1 55

2.9 其他物质

2.9.1 还原剂 还原型谷胱甘肽和巯基乙醇通常作为还原剂添加至培养基中，可以保护细胞免受活性氧损伤，对维持细胞活率起到一定作用。

2.9.2 保护剂 Pluronic F68、甲基纤维素和聚乙烯醇常作为保护剂加入培养基中，可减少细胞与气泡间的黏附力，避免由于气泡破裂对细胞造成的损伤[28]。

2.9.3 诱导剂 丁酸钠作为一种诱导剂，常添加至培养基中用于提高抗体产量[29]，但是丁酸钠的加入可能对抗体的糖基化形式也会有影响。Borys 等[30]通过添加丁酸钠显著降低了 NGNA 的含量。

OFAT 设计指通过改变单一因素的浓度来确定其最优浓度。但由于动物细胞培养基成分复杂，且存在因素间的交互影响，因此该方法只适用于个别组分的优化。Plackett-Burman 设计是一种两水平的试验设计方法，可以通过最少的试验次数从大量考察因素中迅速筛选出显著影响因素，但该方法却忽略了因素间的交互作用[34]。响应面设计则是通过对有限的因子进行建模和函数拟合，考虑因子间的交互关系，已达到最优响应效果的一种方法[35]。混料试验常用于基础培养基和植物水解物的优化，DMEM/F12 培养基便是混料试验的最佳例证[37]。上述 DOE 设计方法均可借助商业化软件完成试验设计，例如 Design Xpert、Minitab 等。

3.2.2 培养基消耗分析 通过检测不同时期细胞培养上清营养物（如氨基酸、维生素、微量元素等）及代谢物（如乳酸、氨、CO2 等）浓度，计算其消耗或生成速率，并在此基础上设计流加培养基组分，既要避免营养物在培养过程中消耗殆尽，又要防止营养物流加过剩，造成代谢副产物累积。目前，市售的商业化仪器已经基本满足上述物质的测定，如生化分析仪（NOVA）、高效液相色谱（HPLC）、电感耦合等离子发射光谱（ICP）等。

3.2.3 代谢组学 代谢组学（Metabolomics）是通过对比不同试验组的所有代谢物组分，寻找其他代谢谱差异的研究方法。通过代谢组学可以提供培养基优化过程中组分改变对于细胞代谢中间产物乃至整个代谢网络的影响，从而为培养基优化工作提供更坚实的理论基础[38-39]。Dietmair 等[39]通过代谢组学研究不同培养基对 CHO 细胞生长（比生长速率和最高细胞密度）的影响，并确定了一系列与细胞生长有关的代谢中间产物。

3.2.4 高通量筛选系统 由于涉及数十种组分的筛选和优化，如采用传统的孔板或摇瓶方式进行培养基开发工作，一方面耗时费力，另一方面试验培养条件的精确控制较难，进而影响对试验结果的判断。而高通量筛选系统（SimCellTM、Micro-24TM、ambrTM 等）的出现不仅能够模拟反应器的控制条件，而且能够实现试验条件的高通量筛选，显著加快培养基开发进程[40]。例如，SimCell 是一种由 Bioprocess 公司开发的用于流加培养的微型生物反应器，能够实时监测细胞密度、活率、pH 和溶氧，每个微反应体积为 650 μl，可同时进行上千个试验[41]。

3 培养基开发策略及手段

3.1 培养基开发策略

尽管 CHO 细胞和 NS0 细胞对于培养基组分的要求有所不同，但是都需要添加数十种组分来维持细胞的正常生长和抗体表达。与此同时，进行培养基优化时不仅需要考虑单一组分的影响，还要关注组分间还可能存在的交互作用，这就使得培养优化成为耗时且复杂的工作。因此，选择合适的培养基开发策略及手段将直接决定培养基的开发时间和最终效果。对于动物细胞的培养基开发策略大体相同，主要分为基础培养基开发和流加培养基开发两个阶段。 3.1.1 基础培养基开发策略 基础培养基是以支持并促进细胞生长为目的，其开发策略可以分两类：自下而上（Bottom-Up）和自上而下（Top-Down）[31]。Bottom-Up 策略是指分别考察单一组分不同浓度对细胞生长和产物合成的影响。该策略由于需要逐一考察每个组分的影响，因此需要大量试验且非常耗时。而 Top-Down 策略则是将培养基首先分成若干“亚类”（subgroup），针对“亚类”进行筛选和组合，而后针对“亚类”内组分进行优化。Ma 等[32]通过 Top-Down 策略成功开发了适合 CHO 细胞和 NS0 细胞的化学成分明确的培养基。需要指出的是，无论通过何种策略开发出的基础培养基，往往需要与流加培养基联合使用，以判断该基础培养基的各类组分是否满足流加培养模式。 3.1.2 流加培养基开发策略 与基础培养基不同，补料培养基的添加是为了增加细胞密度，延长细胞活率，并提高抗体产量，通常包括葡萄糖、氨基酸、维生素和磷酸盐，而无机盐和微量元素往往不包含在内。因此，设计流加培养基一方面要保证营养成分不会耗竭，同时也不能造成乳酸、氨等代谢副产物过度累积。Xie 和 Wang[33]根据杂交瘤细胞组成，葡萄糖、氨基酸和维生素的消耗速率设计流加培养基和流加策略，可以显著地降低乳酸和氨的含量。 3.2 培养基开发手段

3.2.1 试验设计 试验设计（DOE）是一种安排试验和分析试验数据的数理统计方法，以较少的次数、较短的周期和较低的成本，获得理想的试验结果以及得出科学结论。培养基开发过程中常用的试验方法主要有一次一因素（OFAT） 设计、Plackett-Burman 设计、混料设计、响应面设计等[34-37]。

4 结语与展望

近年来，抗体药物在国内外发展势头迅猛。一方面国家通过新药创制科技重大专项为生物医药产业发展提供强有力的科技支撑，另一方面越来越多的抗体药物面临“专利悬崖”，使得国内大量资金流向生物仿制药的研发。

然而，国内大多数企业尚不具备抗体药物开发的关键技术。特别对于培养基而言，90% 以上的企业仍以使用商业培养基为主，使得开发成本居高不下。一旦出现产品质量问题，便很难对培养基进行优化。如何根据细胞株特性设计“个

56 中国医药生物技术 2014年2月第9卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No.1

性化培养基”以满足抗体药物产量和质量的“双重要求”已成为国内从事抗体药物开发企业需要亟待解决的问题。作者期望通过对近年来动物细胞培养基开发研究进行综述，对国内研发人员从事培养基优化起到一定的指导作用，从而提高国内生物制药企业的核心竞争力，早日实现中国抗体产业的繁荣。

参考文献

[1] Genetic Engineering & Biotechnology News. TOP 20 Best-Selling

Drugs of 2012. (2013-03-05) [2013-06-20]. http://www.genengnews. com/insight-and-intelligenceand153/top-20-best-selling-drugs-of-2012/77899775/.

[2] Duan XJ, Liu R, Xu WT, et al. Effect of cell culture conditions on

antibody heterogeneity. Chin J Biotech, 2013, 29(12):1880-1886. (in Chinese)

段须杰, 刘睿, 徐卫涛, 等. 细胞培养工艺条件对抗体异质性影响的研究进展. 生物工程学报, 2013, 29(12):1880-1886.

[3] Beck A, Wagner-Rousset E, Bussat MC, et al. Trends in glycosylation,

glycoanalysis and glycoengineering of therapeutic antibodyies and Fc-fusion proteins. Curr Pharm Biotech, 2008, 9(6):482-501.

[4] Li J, Gu W, Edmondson DG, et al. Generation of a

cholesterol-independent, non-GS NS0 cell line through chemical treatment and application for high titer antibody production. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(7):1685-1692.

[5] Tachibana H, Taniguchi K, Ushio Y, et al. Changes of monosaccharide

availability of human hybridoma lead to alteration of biological properties of human monoclonal antibody. Cytotechnology, 1994, 16(3):151-157.

[6] Nyberg GB, Balcarcel RR, Follstad BD, et al. Metabolic effects on

recombinant interferon -gamma glycosylation in continuous culture of Chinese hamster overy cells. Biotechnol Bioeng, 1999, 62(3):336-347. [7] Chee Furng Wong D, Tin Kam Wong K, Tang Goh L, et al. Impact of

dymanic online fed-batch strategies on metabolism, productivity and N-glycosylation quality in CHO cell culture. Biotechnol Bioeng, 2005, 89(2):164-177.

[8] Genzel Y, Ritter JB, K?nig S, et al. Substitution of glutamine by

pyruvate to reduce ammonia formation and growth inhibition of mammalian cells. Biotechnol Prog, 2005, 21(1):58-69.

[9] Franěk F, Chládková-?rámková K. Apoptosis and nutrition:

involvement of amino acid transport system in repression of hybridoma cell death. Cytotechnology, 1995, 18(1-2):113-117. [10] Ishaque A, Al-Rubeai M. Role of vitamins in determining apoptosis

and extent of suppression by bcl-2 during hybridoma cell culture. Apoptosis, 2002, 7(3):231-239.

[11] Padayatty SJ, Katz A, Wang Y, et al. Vitamin C as an antioxidant:

evaluation of its role in desease prevention. J Am Coll Nutr, 2003, 22(1):18-35.

[12] deZengotita VM, Miller WM, Aunins JG, et al. Phosphate feeding

improves high-cell-concentration NS0 myeloma culture performance for monoclonal antibody production. Biotechnol Bioeng, 2000, 69(5): 566-576.

[13] Hentze MW, Muckenthaler MU, Andrews NC. Balancing acts:

molecular control of mammalian iron metabolism. Cell, 2004, 117(3): 285-297.

[14] Luo J, Zhang J, Ren D, et al. Probing of C-terminal lysine variation in

a recombinant monoclonal antibody production using Chinese hamster

ovary cells with chemically defined media. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(9):2306-2315.

[15] Chaderjian WB, Chin ET, Harris RJ, et al. Effect of copper sulfate on

performance of serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed. Biotechnol Prog, 2005, 21(2):550-553.

[16] Wong VV, Ho KW, Yap MG. Evaluation of insulin-mimetic trace

metals as insulin replacements in mammalian cell cultures. Cytotechnology, 2004, 45(3):107-115.

[17] Saito Y, Yoshida Y, Akazawa T, et al. Cell death caused by selenium

deficiency and protective effect of antioxidents. J Biol Chem. 2003, 278(41):39428-39434.

[18] Pacis E, Yu M, Autsen J, et al. Effects of cell culture conditions on

antibody N-linked glycosylation-what affects high mannose 5 glycoform. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(10):2348-2358.

[19] Keen MJ, Hale C. The use of serum-free medium for the production of

functionally active humanised monoclonal antibody from NS0 mouse myeloma cells engineered using glutamine synthetase as a selectable marker. Cytotechnology, 1995, 18(3):207-217.

[20] Jenkins N, Castro P, Menon S, et al. Effect of lipid supplements on the

production and glycosylation of recombinant interferon-gamma expressed in CHO cells. Cytotechnology, 1994, 15(1-3):209-215. [21] Chen F, Fan L, Wang J, et al. Insight into the roles of hypoxanthine

and thymidine [corrected] on cultivating antibody-producing CHO cells: cell growth, antibody production and long-term stability. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(1):169-178.

[22] Carvalhal AV, Santos SS, Calado J, et al. Cell growth arrest by

nucleotides, nucleosides and bases as tool for improved production of recombinant proteins. Biotechnol Prog, 2003, 19(1):69-83.

[23] Gramer MJ, Eckblad JJ, Donahue R, et al. Modulation of antibody

galactosylation through feeding of uridine, manganese chloride, and galactose. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(7):1591-1602.

[24] Rouiller Y, Périlleux A, Marsaut M, et al. Effect of hydrocortisone on

the production and glycosylation of an Fc-fusion protein in CHO cell cultures. Biotechnol Prog, 2012, 28(3):803-813.

[25] Jing Y, Qian Y, Li ZJ. Sialylation enhancement of CTLA-Ig fusion

protein in Chinese hamster ovary cells by dexamethasone. Biotechnol Bioeng, 2010, 107(3):488-496.

[26] Zhang J, Robinson D, Salmon P. A novel function selenium in

biological system: selenite as a highly effective iron carrier for Chinese hamster ovary cell growth and monoclonal antibody production. Biotechnol Bioeng, 2006, 95(6):1188-1197.

[27] Chen F. Development of serum-free medium for DHFR-CHO cells

and investigation on the roles of some key medium components. Shanghai: East China University of Science and Technology, 2012. (in Chinese)

陈飞. DHFR-CHO细胞无血清培养基及其关键组分的研究和应用. 上海: 华东理工大学, 2012.

[28] Michaels JD, Nowak JE, Mallik AK, et al. Interfacial properties of cell

culture media with cell-protecting additives. Biotechnol Bioeng, 1995, 47(4):420-430.

[29] Jiang Z, Sharfstein ST. Sodium butyrate stimulates monoclonal

antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng, 2008, 100(1):189-194.

[30] Borys MC, Dalal NG, Abu-Absi NR, et al. Effects of culture

conditions on N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) content of a recombinant fusion protein produced in CHO cells. Biotechnol Bioeng, 2010, 105(6):1048-1057.

中国医药生物技术 2014年2月第9卷第1期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No.1 57

[31] Ozturk S, Hu WS. Cell culture technology for pharmaceutical and

cell-based therapies. Boca Raton: CRC Press, 2006:41-80.

[32] Ma N, Ellet J, Okediadi C, et al. A single nutrient feed supports both

chemically defined NS0 and CHO fed-batch processed: improved productivity and lactate metabolism. Biotechnol Prog, 2009, 25(5): 1353-1363.

[33] Xie L, Wang DI. Fed-batch cultivation of animal cells using different

medium design concepts and feeding strategies. Biotechnol Bioeng, 1994, 43(11):1175-1189.

[34] Zhang H, Wang H, Liu M, et al. Rational development of a serum-free

medium and fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody. Cytotehnology, 2013, 65(3):363-378.

[35] Parampalli A, Eskridge K, Smith L, et al. Development of serum-free

media in CHO-DG44 using a central composite statistical design. Cytotehnology, 2007, 54(1):57-68.

[36] Chun C, Heineken K, Szeto D, et al. Application of factorial design to

accelerate identification of CHO growth factor requirements. Biotechnol Prog, 2003, 19(1):52-57.

[37] Kim SH, Lee GM. Development of serum-free medium supplemented

with hydrolysates for the production of therapertic antibodies in CHO cell cultures using design of experiments. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83(4):639-648.

[38] Chong WP, Yusufi FN, Lee DY, et al. Metabolomics-based

identification of apoptosis-inducing metabolites in recombinant fed-batch CHO culture media. J Biotechnol, 2011, 151(2):218-224. [39] Dietmair S, Hodson MP, Quek LE, et al. Metabolite profiling of CHO

cells with different growth characteristics. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(6):1404-1414.

[40] Kim BJ, Diao J, Shuler ML. Mini-scale bioprocessing systems for

highly parallel animal cell culture. Biotechnol Prog, 2012, 28(3):595- 607.

[41] Amanullah A, Otero JM, Mikola M, et al. Novel micro-bioreactor high

throughput technology for cell culture process development: reproducibility and scalability assessment of fed-batch CHO cultures. Biotechnol Bioeng, 2010, 106(1):57-67.

·行业动态·

乙肝疫苗问题调查结果公布 深圳康泰疫苗恢复使用

国家食品药品监管总局和国家卫生计生委对深圳康泰生物制品股份有限公司及其所生产的重组乙型肝炎疫苗展开全面调查。根据现场检查报告、产品抽验结果、质量回顾分析以及病例调查诊断等情况，未发现深圳康泰生物制品股份有限公司生产的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）存在质量问题。1 月 17 日，国家食品药品监管总局和国家卫生计生委联合发出通知，决定恢复深圳康泰生物制品股份有限公司重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）的使用。

两部门现已完成产品检验和病例调查诊断等相关工作。情况通报如下： 一、企业产品检验情况

截止到 2014 年 1 月 14 日，中国食品药品检定研究院对国家食品药品监督管理总局组织抽取的深圳康泰生物制品股份有限公司生产的 6 个批次的乙肝疫苗样品合计 1315 支进行了检验。中国食品药品检定研究院对上述 6 个批次样品进行了全部项目的检验，包括：鉴别试验、外观、装量、pH 值、铝含量、体外相对效力测定、无菌检查、异常毒性检查、细菌内毒素检查。检验结果显示，该 6 个批次样品的全部检验项目均符合企业注册标准和国家药典标准。经与批签发数据对比，该 6 个批次样品检验结果与同批次产品批签发结果一致，说明产品质量稳定。

二、病例调查诊断情况

各地报告的 18 例深圳康泰生物制品股份有限公司乙肝疫苗疑似预防接种异常反应病例已全部完成调查诊断工作。1 例重症已康复出院，该病例不排除疫苗引起的异常反应（过敏性休克可能性大）；17 例死亡病例已明确与接种疫苗无关。

详情请登录国家食品药品监管总局网站 http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0051/96214.html、http://www.sda.gov.cn/WS01/ CL0051/96215.html 查询。