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20 min, 离心弃上清, 细胞固定后Gimsa染色, 油镜下观察染色体计数。（4）相对亲和力鉴定: 参照文献[5]。采用非竞争ELISA方法确定单克隆抗体的亲和力。分别以不同浓度（1、 5、 10 g/L）的纯化的DcR3融合蛋白为固相, 加入倍比稀释的纯化mAb及HRP标记的羊抗小鼠IgG, 以OPD为底物测定A492值。按照公式Kaff=(n－1)/2(nAb’－Ab)计算各mAb亲和力大小。（5）Western blot鉴定抗体特异性: 将纯化的DcR3蛋白、 pET28a(+)空载体蛋白、 人结肠癌SW480细胞株培养上清及细胞裂解制成的细胞悬液经SDSPAGE电泳后转印至PVDF膜上, 以1∶5000稀释的小鼠腹水为一抗, 以1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗, 通过ECL显色系统进行Western blot检测。 2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 HAT选择培养3日可见融合的细胞克隆, 融合率为93.0%（269/288）, 阳性克隆率为85.0%（246/288）, 经有限稀释法对阳性克隆进行2～3次克隆, 共获得5株能稳定分泌特异性抗人DcR3的mAb杂交瘤细胞株, 分别命名为1A9、 1B1、 1F5、 1G4及2H6。
2.2 腹水mAb的纯化 腹水经proteinA层析柱纯化后, 进行SDSPAGE凝胶电泳扫描, 鉴定其纯度为95%。相对分子质量（Mr）为146000 (轻链为23000, 重链为50000, 图1）。紫外分光光度法测定纯化蛋白的浓度为15 g/L。
图1 纯化DcR3 mAb(1B1)的SDSPAGE分析（略）
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Fig 1 SDSPAGE analysis of antibodies after ProteinA affinity chromatograph (1B1)
1: Purified mAb; 2: Prepurified mAb.
2.3 mAb的特性鉴定 mAb效价、 亚类、 染色体及亲和常数的鉴定, 结果见表1。
表1 mAb效价、 亚类、 染色体及亲和常数的鉴定（略） Tab 1 Identification of mAb value, isotype, chromosome and affinity constant
2.4 Western blot分析 5株杂交瘤细胞株分泌的抗DcR3 mAb均能与转印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白在Mr约为33000处形成单一的阳性染色带, 并且与pET载体蛋白无交叉反应, 其中1B1 mAb可以识别高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞成分(图2)。 图2 mAb Western blot分析（略） Fig 2 Western blot analysis of the 1B1 mAb
1: Purified DcR3 protein; 2: Induced pET28a(+) ; 3: SW480 lysate; 4: SW480 culture supernatant. 3 讨论
DcR3 mRNA序列全长1114 bp, 含一个开放读码框, 编码300个氨基酸, N末端前29个氨基酸为信号肽序列, 蛋白Mr约35000。DcR3肽链含4个串联的富集半胱氨酸的重复序列, 此为TNFR超家族的共同标志, 但与其他大部分TNFR超家族成员不同的
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是DcR3缺乏跨膜结构, 故属于分泌性蛋白[2]。DcR3可竞争性地与TNF超家族成员FasL、 LIGHT、 TL1A结合, 抑制配体与死亡受体的结合, 从而阻断配体介导的细胞凋亡, 有助于肿瘤细胞、 活化的自身免疫细胞免受机体免疫系统的清除。研究表明DcR3在许多恶性肿瘤组织和细胞株（如人结肠癌SW480细胞株）以及自身免疫病的外周血单个核细胞（PBMC）过度表达[1, 6]。另有研究发现, DcR3表达水平与肿瘤分化类型和分期密切相关[7, 8], 因此, 应用DcR3抗体通过免疫组化、 ELISA等方法观察DcR3在病变组织或体液中的表达情况对相关疾病的诊断、 预后及疗效观察具有重要作用。此外, 也可以利用DcR3 mAb中和DcR3蛋白, 解除其对肿瘤的抗凋亡和下调宿主免疫功能的作用, 达到辅助治疗肿瘤的的目的。
我们利用本室自制并已经过纯化和鉴定的HisDcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 在传统的淋巴细胞杂交瘤技术基础上进行了以下优化: （1）改进免疫方案, 选择融合时机, 直至小鼠产生百万以上高抗体滴度时方进行融合, 此时分泌抗体的脾脏B淋巴细胞多, 大大增加了阳性克隆率; （2）根据融合后细胞生长情况适当增减HAT和HT用量, 以免毒性过大细胞死亡或剂量不足不能起到筛选作用; （3）对杂交瘤进行ELISA双筛选, 去除DcR3融合蛋白中His蛋白的干扰, 相对提高了免疫抗原的特异性, 保证所筛选到的杂交瘤细胞所分泌的mAb只针对DcR3抗原决定簇而非His决定簇。通过上述优化, 获得了高效价、 特异性强的抗人DcR3 mAb, 其中1B1杂交
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瘤细胞株分泌的mAb可识别高表达DcR3蛋白的人结肠癌SW480细胞株的细胞裂解悬液和培养上清。所建立的杂交瘤细胞株经数次冻存、 复苏, 体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌高效价mAb。总之, 抗人DcR3 mAb的成功研制， 为研究DcR3蛋白功能、 纯化DcR3蛋白、 临床上检测相关疾病血清DcR3含量及在组织细胞的表达分布奠定实验基础。 【参考文献】
[1] Yu KY, Kwon B, Ni J, et al. A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily (TR6) suppresses LIGHTmediated apoptosis[J]. J Biol Chem, 1999, 274(20): 13733-13736.
[2] Migone TS, Zhang J, Luo X, et al. TL1A is a TNFlike ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulator[J]. Immunity, 2002, 16(3): 479-492.
[3] 吴春风, 马忠森, 王秀丽, 等. 人DcR3融合蛋白的表达、 纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2007， 23（12）: 1160-1162.
[4] 赵永芳. 生物化学技术原理及应用[M]. 北京: 科学出版社, 2002: 429-430.
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