广州鸿琪光学仪器科技有限公司
值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均值为M1，若
M1>M0+2SD，表明最低检测限≤0.1ng/ml（≥95%置信区间）。
试验结果：
包被浓度 0.3mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml 2.0mg/ml 2.5mg/ml M0+2SD M1 结论：当包被浓度分别达到1.0mg/ml， 最低检测限≤0.1ng/ml，而进一步提高包被浓度，这个项目的灵敏度没有明显的改变。最终确定这个项目检测线包被浓度均为1.0 mg/ml。 2． 对照线包被浓度
试验设计：固定加液量（喷量1.0μl/cm，电机速度511HZ），用包被缓冲液调整羊抗鼠IgG抗体浓度为0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，以阴性标本加样比较不同包被浓度对照线显色时间。
试验结果：
羊抗鼠IgG 0.5mg/ml 0.8mg/ml 1.0mg/ml 1.5mg/ml 2.0mg/ml 对照线显色时间 超过4 min 超过4 min 2min 2min 2min 结论：包被浓度达到1.0mg/ml，对照线即在2 min内清晰可辩，符合设计要求。最终确定对照线包被浓度1.0mg/ml。
3． 胶体金标记抗PCT单克隆抗体(mAb1)的制备
3.1胶体金与标记蛋白用量之比的确定
试验设计：将胶体金分装15管，每管1ml，每个项目5管。将抗PCT单克隆抗体(mAb1)分别以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml浓度加入上列胶体金溶液中，快速搅
5
广州鸿琪光学仪器科技有限公司
拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟（10000转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮。
以金标记物干燥基础液对金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)进行按一定比例稀释， 然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量1.0μl/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，37±2℃，干燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。
分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均M1，若M1>M0+2SD，表明最低检测限≤0.1ng/ml（≥95%置信区间）。比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。
包被浓度 0.3mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml 2.0mg/ml 2.5mg/ml M0+2SD M1 结论：当标记浓度分别达到20μg/ml, 试剂盒能满足最低检出量参考品0.1ng/ml检出要求，而进一步提高包被浓度，这三个项目的检测线显色程度没有明显的改变。最终确定标记浓度均为20μg/ml。
3.2金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)稀释浓度的确定
试验设计：将抗PCT单克隆抗体(mAb1)用金标记物干燥基础液按1：1、1：2、1：3比例进行稀释，稀释好后按固定喷金参数，将金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)喷在玻璃纤维上，干燥，按正常生产工艺组装试剂条，
分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均M1，若M1>M0+2SD，表明最低检测限≤0.1ng/ml（≥
95%置信区间）。比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。
稀释浓度 1:1 M0+2SD 6
M1
广州鸿琪光学仪器科技有限公司
1:2 1:3 结论：只有当稀释度达到1：1时，最低检测限≤0.1ng/ml，符合设计要求。最终确定金标单抗稀释度为1：1。 4． 设计定型
通过以上实验，我们确定采用的生产工艺为： （1） NC膜包被：
检测线：用包被缓冲液稀释抗PCT单克隆抗体(mAb2)到终浓度为1.0mg/ml。 对照线：用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml。 包膜参数：喷量1.0μl/cm，电机速度511HZ。
将包被好的NC膜放置烘房中，37±2℃，干燥24小时。 （2）胶体金标记：
以20?g/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体(mAb1)加入胶体金中。快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟（4000转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮。然后用金标记物干燥基础液分别按1：1进行稀释，然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量1.0μl/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，37±2℃，干燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。
成品检验：组装成的试剂条是否在15分钟内检出降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml。 成品检验结果：
组装成的试剂条能在15分钟内检出降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml。
结论：该生产工艺生产出来的试剂条符合我们的产品要求，确认为以后采用的生产工艺。
五、质控标准及内部质控品的确立
1. 企业标准的制定的缘由
由于目前人降钙素原的检测尚无一个统一的国家标准或国际标准，我们参考已上市的人降钙素原检测试剂盒产品的性能指标，设计了本品的企业内部标准，制定了内部校准品和质控品。 2.质控标准 2.1 准确性标准：
7
广州鸿琪光学仪器科技有限公司
取PCT零浓度参考品，作为基础样本，将其等体积分为4份，在任意3份中添加PCT纯分析物，使加入浓度分别为5ng/ml、15ng/ml、40ng/ml，制成3份回收样本，分别计算其回收率，然后计算平均回收率，平均回收率应≥95%。 2.2 最低检测限标准
分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均M1，若M1>M0+2SD，表明最低检测限≤0.1ng/ml（≥
95%置信区间）。
最低检测限必须≤0.1ng/ml。 2.3线性标准
用50ng/ml的高浓度参考品和0.1ng/ml的低浓度参考品，混合成8个稀释浓度（Xi），每个浓度测定3次，分别求出检测结果均值即为实测值（Yi）。以稀释浓度（Xi）为自变量，以检测结果实测值（Yi）为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数（r）及线性相对偏差，要求线性相关系数r≥0.975，线性相对偏差不超过±15%。 2.4精密性标准
批内：用同一批次试剂盒分别对企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品进行检测，各平行测定10次，批内变异系数CV≤15%。
批间：取三个不同批次的产品，分别测定企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品，每个批号重复检测10次，批间变异系数CV≤20%。 3. 内部质控品的制备
3.1 最低检出量质控品的制备和验证 3.1.1 降钙素原零浓度质控品的制备和验证
制备方法：10份经确认PCT为阴性、无肉眼可见的溶血、黄疸、乳糜颗粒，HIV抗体、HBV抗原、HCV抗体检测均为阴性的血清标本，进行混合。经离心、过滤等处理后，然后经罗氏诊断产品(上海)有限公司的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)进行检测,确认PCT浓度为0ng/ml，加2/万叠氮钠，分装标识后，-20℃或以下温度保存，有效期2年。
验证方法：将降钙素原零浓度质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒（胶体金法）上加样检测，要求检测结果为＜0.1ng/ml，说明该质控标本可以作为本试剂盒的零浓度质控品。 3.1.2降钙素原定值质控品的制备和验证
从Hytest公司购买PCT纯化品，用零浓度参考品作为基础液进行稀释，稀释到一系列浓度，经罗氏诊断产品(上海)有限公司的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)检测,确认
8
相关推荐：
loading