感受态细胞的制备
一、 实验原理
受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、 材料及准备工作 一）材料准备 试剂、耗材名称 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 琼脂粉 聚乙二醇（PEG8000） DMSO MgCl2 KCl CaCl2 氨苄青霉素 摇菌管 平皿（10cm） 品牌 货号 500ml锥形烧瓶 枪头（1ml，0.2ml） 0.22μm过滤器 50ml注射器 二)试剂配制
1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）
蛋白胨 酵母提取物 氯化钠（NaCl）
2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）
蛋白胨 酵母提取物 氯化钠（NaCl） 琼脂粉
2×1.0g 2×0.5g 2×1.0g 2×1.5g 2.0g 1.0g 2.0g
温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液（100ml）（有效期2周）
聚乙二醇（PEG8000） DMSO
10g 5ml
终浓度10% 终浓度5%
MgCl2(1mol/L） LB
5ml 85ml
终浓度50mmol/L 终浓度85%
去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用 注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）
KCl（2mol/L） CaCl2(1mol/L) MgCl2(1mol/L)
2.5ml 1.5ml 2.5ml
水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）
5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）
取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计
9、微量移液枪 10、低温冰箱
三、 步骤及注意事项 一）感受态制备（TSS法）
1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；
2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；
3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；
4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；
5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态； 6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。 二）KCM法转化
1、冰上融化1管感受态细菌（也可室温化解后，再迅速冰浴）； 2、重取1个1.5ml离心管，加入20μl 5×KCM，DNA（建议不要超过10ng），水至100μl，放置冰中；
3、加入100μl 感受态细菌，混匀，继续冰中放置20-30mins； 4、42 ℃ 热休克 90s后，再插入冰中1-5min；（休克30s效果更好） 5、加入1 ml 37℃预热的LB（无氨苄），转移至摇菌管中，220rpm ，
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