无菌水试管6支，按10－3～10－7顺序编号，放置试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面；以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在手上，不能乱放在桌上)，将1m1移液管的吸液
端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后准确吸取1 m1 10－2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有9 ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将1 m1 10
－2
土壤稀释液注入9 m1无菌水试管内，制成10
－3
的土壤稀
释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽，右手持l0－3稀释液试管在左手上敲打20～30次，混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出1 m1 10－3的稀释液，置第二支装有9 ml无菌水试管中，制成10－4土壤稀释液。用同法再制成10、10、10
－5
－6
－7
的土壤稀释液(为避免稀释过程产生误差，进
行微生物计数时，最好做每一个稀释度更换一支移液管)。最后用毕的移液管重新放入纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中，用3％～5％来苏尔水浸泡1h后再灭菌洗涤。
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图4－5 稀释分离无菌操作示意图
1.从包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管； 3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50℃培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤。
倾注法分离：取无菌培养皿6～9个，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10方法分别吸取1m1 10、10
－6
－5
－7
土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按无菌操作技
－6
－5
术加到相应编号10－7的无菌培养皿内。再以相同
的土壤稀释液，各加到相应编号为10、10
的无菌培养皿
内。将己灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45～50℃左右，分别倾入到已盛有10－5、10－6、10－7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多，也会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拨开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12～15m1，将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置桌上。整个操作过程见图4－5，4－6。
培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养24～48h后，观察结果。 2）放线菌的分离
制备土壤稀释液：称取土样l g，加入到一个盛有99 ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，并加入10滴l0％的酚溶液(抑制细菌生长)，有时也可不加酚。振荡后静置5min，即成10
～2
土壤稀释液。
倾注法分离：按前法将土壤稀释液分别稀释为10－3、10－4、10－5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1m1 10－5、10－4、10－3土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行皿。
培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养5～7d后观察结果。
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图4－6 稀释分离过程示意图
3）霉菌的分离
制备土壤稀释液：称取土样5g，加入到一个盛有95 m1无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10 min，即成10－2土壤稀释液。
倾注法分离：依前法将土壤稀释液再稀释成10－3、10－4的土壤稀释液。然后用无菌移液管分别吸取1m1 10－4、10－3、10－2土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内。采用马铃薯培养基倾倒平板，为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马铃薯培养基临用前需无菌加入孟加拉红、链霉素和去氧胆酸钠。每个稀释度作2～3平行皿。
培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养3～5d后观察结果。 4）酵母菌的分离
制备菌悬液：称取面肥1g，加入到一个盛有99 ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，面肥发黏，用接种铲在锥形瓶内壁磨碎后移入无菌水或生理盐水内，振荡20 min，即成10释液。
涂布法分离：依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述10、10、10
－6
－5
－4
－2
的面肥稀释液。若选用果园土样，也依前法称取1g土样，制成10
－2
土壤稀
三个稀释度菌悬液0.1ml，
依次滴加于相应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿
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培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破（图4－7）。
培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养2～3d后观察结果。
图4－7 涂布操作过程示意图
2. 划线分离法
菌种被其它杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种针上的菌(图4－8A)；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60～70°划线(见图4－8B)，每换一次角度，应将接种针上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。
A.连续划线法 B.分区划线法 图4－8 划线分离方式
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