充气机：罗茨鼓风机、空气压缩机或小型充气泵。 空气过滤器：保持空气清洁，防止污染。
充气管：供气管采用灰塑料硬管，池内充气管多采用塑料软管。
第六节
微藻培养方法（培养工艺流程） 一、容器、工具的洗涤和消毒 1.物理消毒法 （1）加热消毒法
直接灼烧：接种环、镊子等金属小工具，试管口，瓶口等。 煮沸：小型的容器、工具。
烘箱干燥：移液管、小型的三角烧瓶、试管等。 高压灭菌：移液管、小型的三角烧瓶、试管等。 (2)紫外线消毒法
具杀菌力的波长：200-300nm, 226-256nm杀菌力最强
微藻培养方法
紫外线是利用紫外灯管进行的，这种方法对空气和物品表面消毒效果较好。 紫外线消毒时间：20-30min 2. 化学消毒法
在生产中，大型容器、工具及培养池一般用化学药品消毒。消毒前，先将容器工具洗刷干净。 (1) 酒精（乙醇，C2H5OH）：70%-75%酒精。 (2) 高锰酸钾（KMnO4）：
浓度：按10-20mg/L的比例配成溶液 小型容器、工具：浸泡5min。
玻璃钢水槽和水泥池：淋洒池壁，泼洒池底。或池壁用抹布擦，池底用刷子刷。 (3) 石炭酸（苯酚，C6H6OH）：在3~5%石炭酸溶液浸泡30 min。
(4) 盐酸（HCl）：在10%盐酸溶液中浸泡5 ~10 min。适用于玻璃器皿的消毒，铁、铝、水泥池等不能用HCl消毒。 (5) 漂白粉（Ca(ClO)2）或漂白液（NaClO）： 小型容器、工具：在1~5%漂白粉溶液中浸泡30 min。
玻璃钢水槽和水泥池：淋洒池壁，泼洒池底。或池壁用抹布擦，池底用刷子刷。 注意：用上述化学药品消毒完毕，都要用消毒水冲洗2-4次。 二、培养液的制备
微藻培养液（液体培养基）是在消毒海水中加入营养盐配成。 1. 海水来源及消毒方法： （1）Water sources:
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The source of seawater may determine one’s success in culturing certain species. To obtain natural seawater free from pollution, it may be necessary to collect offshore water. ?
Because it is low in nutrients and trace metals, and these components can be added in required amounts in an enrichment solution. In addition, this water contains less sediment and possibly less phytoplankton, making it easier to filter. ?
Nearshore water（近岸水）may be seasonally variable due to rainfall and runoff inputs（径流输入 ）, which may have elevated nutrients and sediments and decreased salinity. ?
Depending on where the seawater is collected, the salinity varies, especially with different seasons.
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? ?
Offshore seawater salinity normally ranges 32 to 35 psu, whereas inshore water may often be <30 psu. Most algae grow well between 30 and 35 psu, but some species do not tolerate reduced salinities.
（2）海水消毒方法：加热、过滤、漂白粉消毒和紫外线消毒。
选用消毒方法应考虑以下几方面：能够杀灭敌害生物； 经消毒处理后的海水无毒； 水消毒方法必须经济、简单、易行。
海水消毒：
实验室或生产上保种：
?海水?沉淀?过滤（脱脂棉过滤、滤膜过滤、砂滤）?煮沸消毒(或高压灭菌autoclave) 。 ?国外某些实验室：海水?沉淀?加活性炭?高压灭菌?滤膜过滤?高压灭菌 大规模生产：
?海水?沉淀?砂滤?漂白粉（漂白液）等化学药品消毒。 ?
The choice of filter pore size is determined by the source of the seawater, its intended use, and the volume needed. Normally, water should be filtered to 0.45?m with membrane filters or, in special cases, down to 0.2?m. ?
Occasionally, dissolved organic matter(溶解有机物) removal may be required for special projects or because of suspected contamination. Dissolved organics may be removed by adsorption onto activated charcoal（活性炭）. ?
Dissolved organics in small volumes of seawater may be removed by adding 2g of powdered(粉状的), washed charcoal per liter of seawater, stirring for 1 hour and then filtering. Large volumes of seawater are passed through charcoal in a glass column. ?
Filtered seawater can be stored in either glass or plastic containers. The seawater should be kept cool (refrigerated if possible) and in the dark (or covered with black plastic). ?
Filtered seawater is traditionally sterilized by steam autoclaving for 15 minutes at 121oC or longer, depending on the volume. ? ?
Autoclaving (高压灭菌)drives carbon dioxide (二氧化碳) out of the seawater, causing a shift in the carbonate buffer system. After autoclaving, leave the media for 24 hours to equilibrate, so that gases such as CO2 are allowed to diffuse into the medium.
漂白粉或漂白液消毒：
目前生产上最常用的是漂白粉（Ca(ClO)2）或漂白液(NaClO)。能起到消毒作用的成分，是其中所含的有效氯。 2NaClO+H2O?2NaOH+Cl2+O 漂白粉：有效氯含量30％-35%
漂白精：是把漂白粉除去杂质提纯而得到的产品，有效氯含量60-70% 漂白液：有效氯含量5％-8% 有效氯
有效氯是氯化物所含的Cl中可起氧化作用的比例。是指某化合物中所含可被释放的氯量。有效氯是衡量含氯消毒剂氧化能力的标志。 有效氯漂白粉中有效氯的测定：碘量法，蓝墨水快速测定法。
碘量法原理：漂白粉中有效氯在酸性溶液中与碘化钾反应而释放出相当量的碘，再以硫代硫酸钠标准溶液来滴定，根据硫代硫酸钠标准溶液的用量计算出漂白粉中有效氯的含量。
消毒时，直接向海水中加入漂白粉或漂白液，使水中有效氯含量20-30mg/L，充气，停放12-24h，可将水中的细菌、杂藻、原生动物等杀死。
参考用量：漂白粉80-100mg/L，漂白液600ml/m3。 使用前，需要用硫代硫酸钠 (Na2S2O3)进行中和。 2Na2S2O3+Cl2?2NaCl+Na2S4O6
在生产上用淀粉碘化钾溶液作为指示剂。
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Cl2 +2KI ?2KCl +I2 I2 +淀粉?蓝紫色反应
20-30mg/L有效氯：可杀死大部分敌害生物，但对危害严重的大型变形虫无法杀灭。 100mg/L有效氯：可杀死包括大型变形虫在内的一切敌害生物。6-9月份使用。 漂白粉消毒海水（或淡水）是生产上最常用的方法，成本较低，消毒也比较彻底。
紫外线消毒海水：
工作原理：利用波长为225nm-275nm 的紫外线对微生物的杀灭作用使水得以净化。水流经水处理器时经紫外光照射，水中的细菌即被杀死。 2.培养液的制备方法
（1）根据所培养微藻的营养需求选择合适的培养基配方。 （2）培养液配制方法
① 称量：将上述配方中药品按扩大1000倍称取，按A、B、C、D、E分别置于5个烧杯内，用蒸馏水溶解（注意：柠檬酸铁需用研砵研碎后，再加热溶解），移入1000ml容量瓶内定容。
②营养盐母液消毒或灭菌：将配制好的各种营养盐母液倒入1000ml试剂瓶中，在高压灭菌锅中灭菌（121℃下灭菌15-30分钟），待压力降到0时取出，冷却后放入冰箱冷藏室中备用。注意：维生素溶液不耐高温，可采用对容器和水分别进行消毒或灭菌的方法或用滤膜过滤的方法进行消毒。
③往消毒海水中加营养盐：取经煮沸消毒冷却后的5000ml海水（盛在5000ml的三角烧瓶中），用5ml的移液管（移液器），按N→P→微量元素→维生素顺序，往消毒的海水中逐一加入各种营养盐母液各5ml，每加入一种母液需摇匀，再加第二种。 三、接种
1. 藻种质量：应选取无敌害生物污染、生活力强、生长旺盛的藻种来进行接种。一般是倒取或抽取上层（上浮性好、浓度高）的藻种进行接种。
（1）肉眼观察 (Visual inspection)
颜色：外观颜色是否正常，一般绿藻类呈鲜绿色，硅藻类呈黄褐色，金藻类呈金褐色。 水中分布情况
附壁和沉淀情况：好的藻种无大量沉淀，无明显附壁现象。
（2）显微镜检查 (Microscopic examination) ：好的藻种细胞颜色鲜艳，运动种类运动活泼，无杂藻和敌害生物存在。 2.接种比例
尽量采用高比例接种。一般1:2--1:5，其中一级培养为1:1。根据接种前后藻种细胞密度等具体情况而定。 由于接种比例高，需要的藻种量大，藻种不足时，可以采用分次加培养液的方法。 3.接种时间
接种时间最好选择上午8—10点进行，而不宜在晚上接种。
培养程序：100毫升三角烧瓶? 500毫升三角烧瓶? 1000毫升三角烧瓶? 3000毫升三角烧瓶?20升细口玻璃瓶（矿泉水桶）? 1方白色塑料桶（1方水泥池）? 5方饵料池 ? 育苗池。
接种用量：1只3000毫升三角烧瓶?1只20升细口玻璃瓶（矿泉水桶）
3只20升细口玻璃瓶?一个1方白色塑料桶（1方水泥池）?2个5方的饵料池。 四、培养管理 1 日常管理操作
1）搅拌和充气：2）调节光照：常用的是太阳光和灯光。3) 营养盐和水分的补充4) 调节酸碱度5）控温
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夏季：通风降温。冬季：水暖、气暖。6)防虫和防雨: 室外开放式培养? 2 藻类生长情况的观察和检查
肉眼观察 (Visual inspection)、显微镜检查 (Microscopic examination) （1）肉眼观察内容：
藻液的颜色、细胞运动情况、是否有沉淀和附壁现象、有无菌膜。 （2）显微镜检查内容：
了解微藻的生长情况，主要是形态和运动情况；检查鉴定敌害生物及杂藻；进行藻类细胞的计数，确定细胞密度（血球计数板 haemocytometer）。 3 出现问题的分析和处理 ? ?
内因: 藻种本身的质量是否优良，
外因: 敌害生物、营养、温度和盐度几个因子。
五、采收
育苗生产上：水泵直接抽取藻液投喂 将藻液浓缩后投喂：过滤、离心 微藻干燥： 实验室：冷冻干燥
食品级产品的干燥：喷雾干燥、转鼓干燥 微藻大规模培养简介
目前微藻大规模培养（large-scale culture, Commercial scale cultivation of microalgae）主要有以下几种方法： 1.开放式大池培养（Open pond culture） 传统、简单的微藻培养系统。
优点：①建设及维持成本较低。②操作简单，技术比较成熟。③空气中的CO2能满足生产需要。
缺点（disadvantages）：①开放培养，容易污染 (easy to be polluted)②藻细胞密度低，后处理工作量大③生产效率低、占地面积大④难以控温(difficult to control temperature)⑤水份蒸发严重(serious water evaporation)，消耗大量水⑥生产不稳定 (unreliable yield)
2. 密闭式光生物反应器（Enclosed photobioreactors） 一般原则:最大限度地增加表面积和体积比。 真正意义上的光反应器： 具有可灭菌的反应容器 配备光照和循环装置、传感器
计算机在线控制：温度、酸碱度、溶解氧、流速等
优点:①封闭培养，不易污染②细胞浓度高，便于后期处理。小球藻：3亿细胞/毫升，绿色巴夫藻：7000万细胞/毫升③生产效率高、占地面积小④封闭系统，水消耗少。
缺点：①建设及维持成本较高②操作较复杂③需要大量CO2。 3. 异养培养 (Heterotrophic culture)
优点：①可进行高密度的纯种培养②可实现培养条件的自动控制。 进行大规模异养培养的主要设施是发酵罐（fermentors）。
缺点：①成本高，操作复杂，技术水平要求高②有些微藻种类无法进行异养培养。
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