Western Blot 步骤

8.1.3 细胞收集与裂解

（1）细胞收集：常规胰蛋白酶消化、离心收集细胞于1.5mL eppendorf无菌管，并做好标记。（2）细胞洗涤：4℃，2500rpm离心5分钟，用4℃预冷的1×PBS洗涤两次。（3）细胞裂解：用100μL事先配好的含有1mM PMSF的RIPA裂解液吹打悬浮细胞，放入-20℃冰箱15分钟，再次吹打悬浮，放入-20度冰箱15分钟。（4）蛋白离心：如此重复两次后，4℃，12000rpm离心10min，取上清（蛋白质）。（5）蛋白总浓度测定：取5μL（或2-5μL）上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白总浓度，实验根据说明书实验步骤操作，测出蛋白-吸光度标准曲线及各组蛋白总浓度。（6）蛋白变性：剩余蛋白样部分以4:1的体积比与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴5min。（7）蛋白浓度均一化：待样品自然冷却后，根据蛋白浓度测定结果，用RIPA稀释好的1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液将各组蛋白调至相同浓度，放入-20度冰箱保存备用。

8.2 SDS-PAGE胶配制

（1）10% SDS-PAGE下层胶配制：按照说明书，依次加入相应体积的超纯水、30?r-Bis、下层胶缓冲液（4×）、10%APS和TEMED，充分吹打混匀后加入1mm厚度垂直电泳槽中，在胶上方轻轻加入超纯水压胶使胶上表面保持平整。（2）5% SDS-PAGE上层胶配制：室温下放置40min左右后，将压胶用的超纯水倒掉，吸除干净，按照说明书，依次加入相应体积的超纯水、30?r-Bis、下层胶缓冲液（4×）、10%APS和TEMED，充分吹打混匀，将配好的上层胶溶液加在下层胶上面，插入梳子。

8.3 蛋白电泳及转膜

（1）蛋白电泳：待电泳胶凝固好后，将胶板放入电泳槽内，加入电泳液，垂直拔出梳子，在加样孔中依次加入等量制备好的样品及4μL蛋白标准；90V恒压下电泳，待样品转移至上层胶和下层胶界面处后，将电压改成恒压110V。在蛋白指示线电泳至距下端1cm左右时终止电泳。

（2）蛋白转膜：待蛋白标准各条带充分分离后，停止电泳；根据所需要的蛋白大小及蛋白标准条带切取所需要的蛋白，将PVDF膜做好标记并记录，用甲

醇活化30s左右后，按照胶在阴极、PVDF膜在阳极的原则，在配好的转膜液中进行170mA恒流转膜，转膜过程中周围加冰水降温。

8.4 抗体孵育及显影

（1）PVDF膜封闭及洗涤：恒流转膜2h，关掉电泳仪电源，取出转上蛋白质的PVDF膜，放入封闭液中，封闭液封闭1-2h后，1×TBST洗涤2次，每次5min。（2）一抗孵育：将PVDF膜转移到相应的以1:1000比例稀释的一抗稀释液中孵育过夜；1×TBST洗涤3次，每次5min。（3）二抗孵育：将PVDF膜转移到相应的以1:1000比例稀释的二抗稀释液中，室温孵育1-2h；1×TBST洗涤5次，每次5min；（4）蛋白显影：暗室中，在X射线摄影暗匣里将PVDF膜含有蛋白质的一面朝上地铺在平整的保鲜膜上，在PVDF膜表面加上配好的BeyoECL Plus混合液，盖上保鲜膜；待反应10-30s后，在其上方盖上3层显影胶片并压片，根据蛋白条带发光情况决定显影时间长短；待显影结束后，将胶片转移到显影液中显影，待条带深浅基本不变后将胶片转移到定影液中定影，定影完成后再将胶片转移到自来水中水洗干净，凝胶成像系统拍照。