微生物学实验 - 第一部分 - 微生物学实验基本技能培训

第三次实验（4学时，1人/组）

微生物标本的制备与染色

实验四 细菌的简单染色法

一、目的要求

1、学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。 2、学习无菌操作技术。

3、进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术。 4、初步认识细菌的形态特征。 二、基本原理

细菌制片常采用涂片法，通过涂沫能使细菌细胞个体均匀分散在载玻片上，有利于观察个体形态。加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，能杀死大多数细菌但不会破坏细胞形态。

微生物染色的基本原理是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透和吸附作用等。化学因素：主要是正负离子之间的相互吸引。染色剂按染料电离后所在地带电荷的性质分为几种类型：酸性染料（如酸性复红，刚果红，伊红和苯胺黑等）、碱性染料（碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰等，细菌易被这种染料染色）、中性（复合）染性（伊红，美兰，Gimsa染料）。

简单染色法是利用单一染料（如吕氏美蓝、碱性品红）对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料电离时的染色部分带正电荷，因此，碱性染料的染色部分容易与细菌结合使细菌着色。在显微镜下因与背景有明显对比而易于识别。 三、实验器材

1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。 2、 染色剂：碱性美蓝染液，石炭酸复红染液。

3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。 四、实验步骤

涂片- 干燥 - 固定 – 染色 – 水洗 – 干燥 - 镜检

1、涂片：取干净载玻片，用记号笔做好标记，滴一滴生理盐水于载玻片中央；用接种环无

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菌操作分别挑取适量菌苔，沾有菌苔的接种环在载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（如果用液体培养物，则用接种环蘸取1-2环菌液直接涂沫于载玻片上）。

2、干燥：自然风干或用电吹风干燥。 3、固定：细菌涂面朝上，通过火焰2-3次。

4、染色：载玻片平放于桌面或载玻片支架上，滴加染液使之覆盖菌膜，一般染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染液，用自来水冲洗，水流宜缓，否则易冲掉细菌涂膜，至洗出的水无色为止。

6、干燥：用吸水纸吸去多余水分，自然风干。 7、镜检：制好的样片在显微镜下观察并记录。 五、注意事项

1、涂片时取菌量要适量，且要求涂布均匀。

2、无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温使菌体变形。

3、涂片需干燥后再加热固定，避免加热时间过长引起细胞易破裂或变形，以至载玻片破裂。加热固定时要用载玻片夹子或镊子，以免烫伤。 4、使用染料时注意避免沾到衣物和实验台面上。 六、实验结果

低倍、高倍、油镜下观察细菌形态图 七、思考题

在进行细菌涂片时应注意哪些环节？为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 八、讲授重点

1、 细菌简单染色的原理。 2、 无菌操作与细菌涂片操作要点。 3、 染色剂的类型与常用种类。 4、 显微镜的使用。 九、实验要求

每位学生至少用一种染色剂对一株菌进行染色、观察、拍照。提交1张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。 十、考核点

涂片质量与油镜下图像的清晰度

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实验五 细菌革兰氏染色法

一、目的要求

1、 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2、 掌握革兰氏染色法操作技术。 二、基本原理

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫－碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘的复合物比较容易洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色是细菌分类的重要依据之一。 三、实验器材

1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）等细菌16-18h斜面培养物。

2、 染色剂：石炭酸复红染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇。

3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。 四、实验步骤

制片 - 初染 - 媒染 - 脱色- 复染 - 镜检

1、制片：与细菌简单染色法的涂片、干燥和固定过程相同。 2、初染：滴加结晶紫染色液于菌膜上1-2分钟，流水冲洗。

3、媒染：卢戈氏碘液冲洗一下菌膜，再滴加该液于菌膜上，静置1分钟。 4、脱色：95%酒精冲洗至无色后，再水洗。

5、复染：番红染色液覆盖菌膜，静置2分钟后水洗，干燥。 6、镜检：显微镜观察。

7、三区涂片染色：在熟悉上述革兰氏染色过程后，在同一载玻片上分别用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（或金黄色葡萄球菌）单独涂片及二者的混合涂片，染色、镜检比较观察。

五、实验注意事项

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1、实验三、四中的注意事项同样适用于本实验。

2、选取活跃生长期菌种、涂片厚度适宜、脱色程度适当，能避免产生假性革兰氏染色结果。 六、实验结果

1、拍摄油镜下观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的单菌涂片及混合涂片的革兰氏染色菌体图。 2、将实验结果填于表3-1。

表3-1 革兰氏染色结果记录表

菌名

七、思考题

1、哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

2、现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是阴性，如何确定你的染色结果的正确性？ 八、讲授重点

1、 细菌革兰氏染色的原理。 2、 革兰氏染色操作要点和结果判断。 九、实验要求

每位同学完成2个单菌涂片及1个三区涂片，进行染色、观察、拍照。记录革兰氏染色结果。提交3张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。 十、考核点

1、无菌操作是否规范 2、染色过程操作是否规范 3、显微镜操作是否熟练

菌体颜色

细菌形态

结果（G+、G-）

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