3. 迅速制备平板。 4℃可保存数月。
2.10 RD 及 RDH的 TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）
1. 将 186g 的山梨醇和 7.5~10g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60℃水浴； 2. 参照 RD/RDH液体培养基配制的步骤 4，将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB； 2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液、（ 10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45℃后，与步骤 1 的山梨醇 / 琼脂液混匀；
3. 将该 TOP琼脂置于 45℃水浴冷却、保温，备用。
2.11 MD 与 MDH
Minimal Dextrose Medium + （Histidine ） 最小葡萄糖培养基 + （ 0.004 % 组氨
酸）
（含有： 1.34%YNB；； 4*10-5% 生物素； 2%葡萄糖）
1. 100ml 的 10*YNB； 2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的无菌水定容至
1000ml 即可；
2. 如配制 MDH，可在上述的 MD中加入 10ml 的 100*H 即可；
3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入
15~20g的琼脂。 4℃可保存数月。
2.12 SOC 培养基：
Trypton
Yeast Extract NaCl
l
0.5 0.05
2%
％
％ ％
Glucose (1mol / L)
121℃高压灭菌 20min ，冷却后， 4℃保存
三．主要试验环节的操作
3.1 酵母菌株的分离纯化
接种 GS115于 5ml YPD 液体培养基， 30℃， 200rpm 振荡过夜，涂布 YPD平板，
30℃培养 48 小时，用 YNB 基本培养基和含 His 的补充培养基作点种分离纯化，挑
选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划
YPD平板， 4℃保存。
3.2 pPICZ α A原核宿主菌 TOP10F’的活化培养
TOP10F’做为菌种保存在－ 70 ℃条件下， 在进行扩大培养抽提质粒之前， 先要进行
活化培养。
接种 TOP10F’于 5ml LLB（加入 25ug / ml Zeocin ）中， 37℃， 200 rpm ，培养 16～
18 小时。
3.3 毕赤酵母表达的试验方法
3.3.1 线状质粒 DNA的脱磷酸化处理
为了防止载体质粒 DNA的自身环化， 用小牛肠碱性磷酸酶 （ CIP）处理酶切后的
质粒 DNA，具体操作如下：
⑴ 建立反应体系：
线性化的质粒
35ul
10x CIP buffer
4ul
CIP
1ul
ddH2O
5ul
——————————————————————————
total
45ul
⑵ 在 PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭）， 37℃， 15 min ；50℃， 15 min ；
56℃， 30 min （灭活）。
⑶ 在 56℃未开始前停止，加入
proteinse K ，用于灭活 CIP，加入试剂如下：
反应物
45ul
10x 5 ％ SDS 7ul
10x EDTA （pH 8.0 ）
7ul
proteinse K ddH2O
5ul
6ul
———————————————————
total
70ul
⑷ 纯化使用 QIAquick spin kit
，按照 2.2.3.3 步骤进行， 20 ul
灭菌 ddH2O洗
脱纯化产物。进行 1％琼脂糖凝胶电泳， 120 V， 观察纯化结果，并大约估计 浓度。
DNA
3.3.2 E.coli TOP10F ’ 感受态细胞的制备及转化
⑴ 取 10 ul TOP10F’ 菌液，接种于 200ml LB 液体培养基中活化培养， 37℃ ，200 rpm， 16～18 小时。取 100 ul 菌液接种于
200 ml 液体 LB 培养基中。
⑵ 37 ℃ ，200 rpm，培养 16～18 小时。
⑶ 灭菌 500 ml 离心管， 4℃， 4000 rpm， 20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体用 10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤 3 次。
⑷ 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约 ⑸ 从制得的感受态细胞中，取 200 ul
1ml 液体用于重悬菌体。
于灭菌 EP管中，加入连接反应产物 5ul ，
混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5 min 。 ⑹ 将混匀后得 200ul 菌液移入电击杯中。 ⑺ 使用电击穿孔仪进行转化，设置为
电压 2500 V ，时间 5 ms 。
⑻ 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌 1.5 ml EP 管中。 37℃， 150 rpm ，轻摇 45～ 60 min 。 ⑼ 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 液不在流动， 37℃ 培养 12～16 小时。
的 LLB－Zeocin 平板上，正放，待涂布
* 注：设空载体做对照。
3.4 毕赤酵母电转化方法
3.4.1 菌体的准备：
1. 挑取酵母单菌落，接种至含有 5ml YPD 培养基的 50ml 三角瓶中， 30℃、 250~300r/min 培养过夜；
2. 取 100~500μl的培养物接种至含有 500ml 新鲜培养基的 2L三角摇瓶中，28~30℃、
250~300r/min 培养过夜，至 OD600达到 1.3~1.5 ；
3. 将细胞培养物于 4℃，1500g 离心 5min，用 500ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀
重悬；
4. 按步骤 3 离心，用 250ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
5. 按步骤 3 离心，用 20ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤 3 离心，用 1ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体 积约为 1.5ml ；
7. 备注：可将其分装为 80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（ 2 周之
内）。
3.4.2 电击转化：
8. 将 5~20μg的线性化 DNA溶解在 5~10μl TE溶液中，与 80μl的上述步骤 6 所得
的菌体混匀，转至 0.2cm 冰预冷的电转化杯 中； 9. 将电转化杯冰浴 5min；
10. 根据电转化仪提供的资料， 参考其他文献及多次摸索， 确定合适的 电压、电流、
电容等参数 ，按优化的参数，进行电击；
11. 电击完毕后，加入 1ml 冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀， 转至 1.5ml 的 EP管中； 12. 将菌体悬液涂布于 MD或 RDB平板上，每 200~600μl涂布一块平板； 13. 将平板置于 30℃培养，直至单个菌落出现。
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