推荐：电压 1.5kV ；电容 25μF；电阻200Ω。电击时间为 4～10msec。
3.5 Pichia 3.5.1
酵母表达直接 PCR鉴定重组子的方法
模板的处理：
1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约 12 小时）；
2. 将除了模板之外的其它 PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit 中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；
3. 用半根灭菌的牙签 （节约，而且好用）挑取菌落 ，在 PCR管中涮以下， 放入一
个灭菌的 1.5 毫升离心管，对 PCR管和 1.5 毫升离心管编号； 4. PCR 扩增， 1％ agarose 电泳；
5. 对于 PCR扩增显现特异性条带的克隆， 把置于 1.5 毫升离心管中的半截牙签扔到 5 毫升 YPDZ培养基中， 30 度培养， 8－ 12 小时后提质粒，酶切鉴定确认。
注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），使用
PCR初
筛可以使工作量大为降低。
3.5.2 PCR 反应体系：
以 TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例：组分 50 μl 体系 20 μl 体系
10xReaction Buffer 5.0
μl 2.0
μ l
25mmol/L MgCl2 3.0 μl 1.2 μl
2.5mmol/L dNTPs 5.0 μl 3.0
μ l
μ l μ l
Primer 1 （10μ mol/L ） 2.5 μl 1.0 Primer 2 （10μ mol/L ） 2.5 μl 1.0
ddH2O 31.5μl 12.6 μl
Taq DNA聚合酶 0.5 μl 0.2
μ l
TOTAL 50.0μl 20.0 μl
3.5.3 PCR 反应条件：
初始变性 94 ℃ 4min
变性 94 ℃ 30s 34
个循环
退火 50~54 ℃ 30s
延伸 72 ℃ 30s
结束延伸 72 ℃ 10min
保存 4℃
3.6 毕赤酵母基因组提取方法 ⑴ 接种重组和空质粒转化子于 30℃，培养 16～ 18 小时。
5ml YPDZ培养基， GS115 菌于 YPD培养基作对照，
⑵ 室温下， 1500 g 离心 5-10min 收集菌体
⑶ 100 ulTE （ pH 7.0 ）重悬，加入 300 ul EDTA （pH 8.0 ）， 0.07M Tris －HCl， 3
ul β- 巯基乙醇， 1ul Lyticase
，37℃水浴 30 min 。
⑷ 10000g 离心 5~10min，取沉淀，加 90ul TE 重悬。
⑸ 200ul 饱和酚， 200ul 氯仿，混匀，离心 30s ，取上层水相。
⑹ 加入两倍体积无水乙醇以及
1/10 体积的 NaAC， -20 ℃放置 30min；
⑺ 10000g 离心 20min，弃上清； 75%乙醇漂洗沉淀一次； ⑻ 干燥后，加入 15 μl的 TE或 H2O溶解， -20 ℃备用。
3.7 Mut+ 表型重组酵母的诱导表达实验
1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、 BMG或 BMGY培养基的 250ml 摇瓶中，于
28-30 °C/250-300 rpm 培养至 OD600 = 2-6 (~16-18 h) ；
2. 室温下 1500~3000g离心 5min，收集菌体，用 MM、BMM或 BMMY重悬菌体，使
OD600 =1.0 左右（约 100~200ml）；
3. 将步骤 2 所得的菌液置于 1L 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于 28-30 °C/250-300 rpm 的摇床上继续生长；
4. 每 24h 向培养基中添加 100％ 甲醇至终浓度为 0.5 ～1.0%；
5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP 管中，最大转速离心 2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间
点一般取： 0、6、12、24、36、 48、60、72、 84 和 96h；
6. 对分泌表达， 分离样品的上清液； 对胞内表达， 分离样品的菌体沉淀， 带检测
样品用液氮或干冰速冻后，于 -80 °C 保存备用；
7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
3.7 Muts 表型重组酵母的诱导表达实验
1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、 BMG或 BMGY培养基的 250ml 摇瓶中，于
28-30 °C/250-300 rpm 培养至 OD600 = 2-6 (~16-18 h)
；
2. 室温下 1500~3000g离心 5min，收集菌体，用 1/5 到 1/10 原培养体积的 MM、BMM 或 BMMY重悬菌体（约 10~20ml）；
3. 将步骤 2 所得的菌液置于 100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于
28-30 °C/250-300 rpm 的摇床上继续生长；
4. 每 24h 向培养基中添加 100％ 甲醇至终浓度为 0.5 ～1.0%；
5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP 管中，最大转速离心 2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间
点一般取： 0、24、48、72、 96 和 120h；
6. 对分泌表达， 分离样品的上清液； 对胞内表达， 分离样品的菌体沉淀， 带检测样
品用液氮或干冰速冻后，于 -80 °C 保存备用；
7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
四 试验的注意事项
4.1 信号肽识别位点的设计
以质粒 pPICZαA 为例。在利用 PCR反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。如果质粒 pPICZαA 双酶切中丢失了 KEX2蛋白酶的酶切位点 Lys－Arg，应该在上游中，增加了编码 Lys、Arg 的密码子 AAA、AGA 。酵母细胞膜中中的 KEX2蛋白酶是
α -factor 信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点 Lys－ Arg，通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外。
4.2 PCR 产物酶切保护碱基的设计
利用 PCR转换酶切位点，通过 P3、P4 两引物的扩增在 rhEGF的两端加上 XhoⅠ、XbaⅠ的识别位点和 5 个保护碱基。
根据限制性核酸内切酶的工作原理，内切酶首先需要结合到核苷酸序列上，并在上
面进行滑行，直至识别到酶切位点，为了能使内切酶有效的结合到序列上以利于其
的有效加工。 在利用 PCR进行酶切位点转换的时候， 通常应在 5' 端限制酶位点外再
加 3 个保护碱基 GC［6］，防止引物合成中因为合成效率和纯化问题而导致的酶
切位点的残缺。
核苷酸保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率，在其识别位点的两侧应该保证一定的旁侧序列，换言之，识别位点是限制型内切酶识别并特异性切割底物的必要而
不充分的条件。鉴于 NEB(NewEngland Biolabs) 公司在限制酶领域的总体研究 水平和对保护碱基方面的独到理解，在设计引物时可以参照NEB公司的产品目录后 面的附录： Cleavage to the end of DNA fragments
进行［ 7］，但是，一些不常
相关推荐：
loading