实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取
一、实验目的
学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料
大肠杆菌（E. coli） DH5α菌株：R-，M-，Amp-
2、实验设备
恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅
3、试剂
酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素
三、实验步骤
液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：
蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0
固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！
(1) 每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2) 用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容
至100ml。
(3) pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4) 将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5) 按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培
养基。
(6) 两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7) 把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高
压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8) 取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9) 取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。
每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。
(10) 另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml
50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11) 接种环蘸取菌液，密密划线。 (12) 倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13) 一天后观察菌落。
四、思考题
(1) 在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌种的什么信息？
(2) 在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？
(3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什么不是正放呢？
(4) 你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？
实验二 碱裂解法小量提取质粒DNA
一 实验目的
了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二 实验原理
本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 三 实验材料
转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株 四 实验设备
微量取液器(100μl,1000μl)， 台式高速离心机
五 试剂
溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 、1％ SDS (临用前用0.4mol/L NaOH和2％ SDS母液稀释)。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L
饱和酚、氯仿、TE缓冲液 六 实验步骤
1. 用移液枪取1.5ml培养液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌体； 2. 弃上清,将管倒置于吸水纸上尽量使液体流尽； 3. 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中；
4. 按试剂配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡，动作轻柔)；
5. 立即加入200μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口并温和颠倒离心管数次，混匀溶液，置冰浴中10分钟； 6. 12000 rpm离心10分钟；
7. 加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀， 12000 rpm 10分钟；
8. 小心吸取上清夜移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟；
9. 12000 rpm离心10分钟；
10. 弃上清, 将管倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入200μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀。 11. 同步骤10，重复洗涤沉淀一次；
12. 弃去乙醇溶液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，室温或37℃下干燥；
13、将沉淀溶于5μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除残留的酚对质粒的后继实验，如酶切反应等的不良影响。
3. 沉淀DNA通常使用冰冷的无水乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇，但由于常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
4. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性。 5．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C A.染色体DNA断成了碎片
B.染色体DNA分子量大，而不能释放 C.染色体变性后来不及复性 D.染色体未同蛋白质分开而沉淀 七 思考题
1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？
答：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2. 溶液II为何必需即用即配？
答：NaOH溶液长时间配制存放会与空气中的CO2反应，降低PH值，影响对细胞的裂解作用。
3. 加入溶液II后作用时间不能长，需要快速加入溶液III中和碱性溶液。如果溶液II的作用时间过长或
者反应过于激烈会导致什么后果？
答：作用时间过长会使细菌的基因组DNA被打断，从而不能被彻底沉淀除去，影响质粒DNA的纯度。 4. 在变性蛋白质的过程中，为何必须注意不要将酚残留在上清液中？ 答：残留的酚对核酸酶具有抑制作用，因而会影响后面质粒DNA的酶切反应。 5. 最后DNA沉淀可以溶解在双蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE缓冲液中，为何？
答：由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl
系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
\\实验三
一、实验目的：
学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性 二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。 三、试剂与仪器设备：
1. 质粒DNA 2. 琼脂糖
3. 6×载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油
4．50×TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。
5．溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
6. DNA Marker：共6条带，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上样6ul时750bp的带约为100ng，
琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
其余带约为50ng
7．各种国产移液器(10，20，100μl) 8．消毒的tips枪头 9．水平电泳槽和电泳仪
四、实验步骤
1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1×TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取1μl DNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。质粒DNA加样完毕，选取一个未
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