6 表面活性剂增敏荷移反应紫外分光光度法测定三聚氰胺
6.1 原理
CTMAB 对三聚氰胺与四氯对苯醌( TCBQ) 荷移反应产物具有显著的紫外光谱增敏作用，反应产物的吸光度值与三聚氰胺的浓度之间具有良好的线性关系。据此建立了一种三聚氰胺的紫外光谱测定新方法。
三聚氰胺分子中-NH2上的氮原子有一对孤对电子，空间阻碍又小，是良好的电子供体，而 TCBQ 是一个很强的平面型 π 电子受体，因此，在乙腈溶液中 MEL 与 TCBQ 形成了 n-π 型荷移配合物。用摩尔比法测得配合物的组成为 1∶ 3，表明是一个三聚氰胺分子中通过三个-NH2上的氮原子与三个 TCBQ 分子进行荷移反应，形成了 n-π型荷移配合物( TCBQ)3MEL，结构稳定，新出现的309nm 吸收峰正是该荷移反应产物的特征吸收峰。其形成原理可表示如下:
当向该体系加入 CTMAB 后，MEL + TCBQ +CTMAB 溶液的特征吸收峰位不变，但峰高明显增强，反映出表面活性剂 CTMAB 对 MEL 与 TCBQ 的荷移反应具有增敏效应.
6.2仪器与试剂
UV-2550 型紫外分光光度计; PB-21 型精密酸度计。 奶粉；
三聚氰胺( sigma 试剂，＞ 99%) 溶液 四氯对苯醌( TCBQ)
乙醇溶液( 1.0 ×10-3mol / L) ;
十六烷基三甲基溴化铵( CTMAB) 溶液( 0.2g/L) ; Tris-HCl 缓冲溶液 pH = 7.55; Tween-20;
十二烷基苯磺酸钠(SDBS) ; 十二烷基硫酸钠(SDS) ; 乙腈。
三聚氰胺分子印迹聚合物固相萃取柱: 自制。 所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。
6.3 实验方法
三聚氰胺分子印迹固相萃取柱的制备：
以三聚氰胺为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以乙醇-水(5:1，V/V) 为溶剂，60℃ 聚合 24 h，制备三聚氰胺分子印迹聚合物。取适量聚合物粉末装入固相萃取空柱中，两端分别用滤膜垫片堵住，备用。
奶粉样品的制备：
参照国标法处理样品: 在离心管中分别准确移取 1 mL 或 1. 0g 牛奶样品，加入 5 mL1% 三 氯 乙 酸 ( pH = 3. 0 )和乙腈混合液（3: 1，V/V) ，超 声 10 min，振 荡 10 min，以8000r / min离心 10 min，转移合并上清液，将上清液减压蒸干，水溶，用0. 45μm微孔滤膜过滤得样液。
吸光度的测定：
于 10 mL 比色管中，依次加入一定量 MEL 工作液、TCBQ 溶液 1.8 mL、 CTMAB 溶液 0.5 mL 和 Tris-HCl 缓冲溶液1.2mL；再取一10ml比色管，依次加入一定量的奶粉样品、TCBQ 溶液 1.8 mL、CTMAB 溶液 0.5 mL 和 Tris-HCl 缓冲溶液1.2mL。所有比色管摇匀，用乙腈定容至5mL，于30℃水浴中反应40min后，取出冷却至室温，用1cm 吸收池，以试剂空白为参比，在309nm 处测其吸光度。
6.4 数据处理
用所得的吸光度值做线性回归方程，求出样品中的三聚氰胺含量。 6.5 共存物质的干扰
当三聚氰胺溶液浓度为 1.0×10－ 6mol/L，测定的相对误差在±5% 范围内时发现，牛奶中一些常见物质对三聚氰胺测定的最大允许倍数分别是:Mg2+( 200) K+
(200) 、Fe3 +(100) 、Ca2 +(50) 、Zn2 +(10) 、蔗 糖 ( 50) 、葡 萄 糖 ( 200) 、麦 芽 糖(200) 、维生素 C(100) 。 2.2.6 样品加标回收率
采用两种方法测定样液，均未检出三聚氰胺。对样品进行三个浓度水平的加标回收率测定，结果见表2.1。可见新建分光光度法测定三聚氰胺结果满意; 用两种方法进行样品预处理时，方法 2 的加标回收率优于方法 1，反映自制固相萃取柱预处理样品效果更好。
表2.1 方法 1 编号 加入量 测量值 回收率 RSD c / ( μmol / L) c / ( μmol / L) / % / % 1 0.4 0.474 118.5 1.9 2 0.8 0.705 88.1 2.1 3 1.6 1.416 88.5 1.5 方法 2 编号 加入量 测量值 c / ( μmol / L) c / ( μmol / L) 回收率 / % RSD / % 1 2 3
0.4 0.8 1.6 0.413 0.788 1.579 103.2 98.5 98.7 1.3 0.7 1.1 7 表面解吸常压化学电离质谱法
7.1 实验原理
由于三聚氰胺呈碱性,在正离子模式下易质子化形成[M+H]+的分子离子,因而在质谱中获得很强的信号峰(m /z127)。选择m /z127分子离子峰进行二级质谱研究,主要得到特征离子m /z110,85,68和60(如图2所示),分别为母离子丢失NH3、NH2CN、NH2CN及NH3、HNCNCN所致,另外,二级质谱碎片离子m /z85的三级质谱中,可产生m /z68的碎片离子,为二聚氰胺质子化离子进一步丢失NH3所致。为了确保结果的可靠性,实验还采用ESI-MS方法对三聚氰胺进行了MS/MS谱对照分析,,并且通过氘代三聚氰胺的SDAPCI-MS/MS谱图对有关特征离子的结构式(如图2及图3所示)进行了确认。如果在实际样品中能够检测到信号峰m /z127,并且在MS/MS谱中观察到主要特征离子m /z110、85(基峰)、68和60,则可以判断该样品中含有三聚氰胺,如图3所示。
7.2 仪器与试剂
SDAPCI离子源:如图1所示。LTQ-XL型线性离子阱质谱仪。三聚氰胺,使用时配置成100. 0 mg/kg水溶液备用;奶粉样品。
7.3 实验方法
线性回归方程建立：
配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取
100uL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。 7.4 数据处理
将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m /z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差。信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01~100 mg/kg范围内,离子强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6)。本方法三聚氰胺的检出限为8. 8Lg/kg。
7.5 线性范围、检出限、回收率和精密度
配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100LL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m /z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差(括号内)依次为: 58(9.2% )、72(3.9% )、98(5.6% )、145(8.3% )、205(5.8% )。信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01~100 mg/kg范围内,离子强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。线性回归方程Y=0.1402X+2.0168,相关系数r=0. 990。
对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6),并测得空白样品的3倍标准偏差为6. 336(S/N=3, n=20),计算得本方法对三聚氰胺的检出限为8. 8Lg/kg。
回收实验时,在9份0. 1 g奶粉样品中, 3份加入100LL水, 6份分别加入100LL 1. 0 mg/kg和5.0 mg/kg(各3份)三聚氰胺的标准溶液,按照实验方法进行测定。获得样品中三聚氰胺含量为2. 2 mg/kg(n=6),加标回收率分别为: 93. 1%、105. 4%、112. 8%、97. 5%、86. 7%、10312%。这可能是由于手动进样时的不稳定性(如抖动等原因)和样品表面不均匀性造成的,如果采用自动进样则可能克服此问题,进一步提高其分析性能。
8 超高效液相色谱-串联质谱法
8.1原理
三聚氰胺是一种弱碱性化合物,微溶于冷水,可溶于甲醇、乙腈、甲醛、乙酸、三氯乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。本实验以含5%乙酸铅的三氯乙酸的溶液做为提取液,能够有效沉淀样品基质中的蛋白。样品经过甲基叔丁基醚的液液萃取,能有效地除去基质中的油脂。采用混合阳离子交换固相萃取柱能进一步除去样品基质干扰,提高方法的回收率及灵敏度。 8.2 实验仪器与试剂
Agilent1200超高效液相色谱仪 离心机
涡旋混合器 固相萃取仪 氮吹仪
乙腈(HPLC级),甲醇(HPLC级),乙酸铵(HPLC级),超纯水,三聚氰胺标准品(纯度>99%),三氯乙酸(分析纯),乙酸铅(分析纯),氨水(分析纯),水(超纯水), PCX混合阳离子交换柱(60 mg/3 mL)。三聚氰胺标准储备液(1 mg/mL),三聚氰胺
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