二、选项题（单选或多选）
1．下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( C )是不正确的。
A．质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数 B．可以在氯霉素作用下进行扩增 C. 通常具有较少的拷贝数 D．同严紧型质粒整合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子
2．基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有( B )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体。
A．pBR322 B．pSC101 C．pUB110 D．pUC18 3．下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大？ ( C )
A．质粒 B．黏粒 C．酵母人工染色体(YAC) D．λ噬菌体 E．cDNA表达载体 4．松弛型质粒（ D ）。
A．在寄主细胞中拷贝数较多 B．可用氯霉素扩增 C．一般没有选择标记 D．上述A、B两项正确
5．Col El是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒 ( ACD )。 A．是松弛复制型 B．具有四环素抗性 C．能被氯霉素扩增 D．能产生肠杆菌素
6．同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时它们的迁移速率是( B )。 A．OC DNA>SC DNA>L DNA B．SC DNA>L DNA>O CDNA C．L DNA>OC DNA>SCDNA D．SC DNA>OCDNA>LDNA 7．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确? ( B )
A．在不同的宿主中具有不同的复制机制 B．在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 C．在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 D．在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率 8．Ti质粒 ( ACDE )。
A．可从农杆菌转到植物细胞中 B．作为双链DNA被转移
C．在植物中导致肿瘤 D．介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素 E．需要细菌的vir基因帮助转移 F．在植物细胞中作为染色体外质粒 9．下列哪些属于重组DNA分子? ( C )
A．PCR扩增的DNA片段 B．单链RNA与单链DNA杂交得到的产物 C．人基因组片段与质粒载体连接的产物 D．存在于细菌细胞内的λ噬菌体染色体 E．质粒经限制性内切核酸酶酶切后的产物
10．LacZ基因通常用于构建质粒载体的目的是什么？( E )
A．编码一种限制性内切核酸酶，在转化细胞时用于切割载体 B．编码蓝色色素产物，可用于示踪转化的细胞
C．编码一种酶，将RNA转化为DNA D．编码一种抗生素抗性的酶
E．编码一种可检测的酶,当基因内部的位点插入任何外源片段，ORF遭到破坏时，产物即不能表达 11．一个质粒含有四环素抗性基因( tetr )和LacZ基因，tetr内有一Hind III位点，LacZ中有一Eco RI位点。如用这两种酶切割载体，并连接入相应的外源DNA片段，则带有该重组质粒的细胞将 ( D )。 A．有四环素抗性，在X-gal平板上呈现蓝色 B．对四环素敏感，在X-gal平板上呈现蓝色 C．有四环素抗陛，在X-gal平板上呈现白色 D．对四环素敏感，在X-gal平板上呈现白色 12．质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了 ( E )。
A．赋予宿主细胞某种可检测的特性 B．可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离 C．独立复制的能力 D．可复制自身DNA以及插入的外源DNA E．甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解 13．下列对质粒特性描述中，不正确的是 ( AC )。
A．既能以单链环状又能以双链环状的形式存在。 B．是独立于细菌染色体DNA以外的复制子 C. 没有线性的质粒DNA D．能够自我复制
三、判断题
1．迄今发现的质粒DNA都是环状的。错误。链霉菌属质粒为线状
2．一个带有反向重复序列的双链DNA经变性后，复性时其单链可形成发夹环。正确 3．能够在不同的宿主细胞中复制的质粒叫穿梭质粒。正确
4．任何一种质粒都可以用氯霉素扩增的方法，增加它的拷贝数。错误，对氯霉素抗性质粒不能 5．只有完整的复制子才能进行独立复制，一个失去了复制起点的复制子不能进行独立复制。正确
6．CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA的原理是根据EB可以较多地插入到SC DNA中，因而沉降速度较快。错误，EB插入SC DNA量少，密度改变较小，离心后停留在较高部位密度小的地方 7．质粒ColE1同pSC101共整合后，得到的重组质粒pSC134，具有两个复制起始点，这两个起始点在任何细胞中都是可以使用的。错误，一般使用ColE1的复制起始点
8．所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。正确 9．一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。错误，主要是独立存在
10．ColE1是惟一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。错误，其
无四环素抗性基因
11．某一染色体DNA经内切酶Sal I切割后，产生了若干个具有黏性末端的DNA片段，将这些片段分
别在T4 DNA连接酶的作用下自身连接成环，然后导入受体细胞，这些片段都可以进行独立地复制。错误，无复制子
12．基因克隆中，低拷贝数的质粒载体是没有用的。错误，对有剂量限制的基因克隆需用低拷贝质粒载
体
四、问答题
1．列举质粒载体必须具有的基本条件。
答：(1)能独立复制； (2)具有选择标记；
(3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。
2．举例说明什么是穿梭载体？
答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主 (来回穿梭)。
3．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全。进行严格地监控对质粒载体的安全是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?
答：(1) 非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移。
(2) 具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307 (ColE1的衍生质粒) 在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中。
(3) 一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。 (4) 有较小的宿主范围。
4．YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？ 答：（1）功能性DNA序列: ①来自于酵母的125bp DNA片段的着丝点序列 (CEN4)。 ②来自酵母的自主复制序列 (ARS1)，起始在酵母中的DNA复制。 ③来自酵母的端粒序列，它是 (5-TGTGGGTGTGGTG-3) 的多拷贝重复，它对染色体的复制和维持是必需的。 ④在酵母中进行选择的标记基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是这些基因的营养缺陷性，只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活 ⑤具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC载体通常含有ColE1的ori和氨苄青霉素抗性标记基因，可以在大肠杆菌中复制和繁殖，所以它也是一种穿梭载体。
（2）优越性：YAC能够容纳长达上千kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入
更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
5. 什么是YAC？YAC克隆载体常出现哪些问题？
答：YAC 即酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome）的缩写，是人工构建的染色体样大容量克隆载体，基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA克隆片段可达到2000kb。
问题有：(1) YAC有嵌合现象，一个YAC中克隆的DNA片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的10％～60％。
(2) YAC内部有重组现象，插入的DNA较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。
(3) YAC还有缺失现象，影响YAC文库的代表性。
(4) YAC结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。 (5) 构建好的YAC转化原生质化的酵母菌，转化效率低。 (6) 建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大 6．什么是 BAC？BAC 载体的组成与优缺点有哪些？ 答：⑴ BAC即细菌人工染色体，是从大肠杆菌F因子改造构建而来的，能够携带大约300kb的DNA插入片段。
⑵ 组成：①BAC载体具有F因子的复制起始点（oriS），可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。
②载体包括有4个维持DNA复制和拷贝数目的基因，repE, parA, parB and parC。
③具有一个抗生素选择标记基因，和lacZ’基因。在lacZ’基因中组装有一多克隆位点，便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。
④插入的DNA片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。
⑶ 主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（1~2个），使得分离和筛选较为困难。 7．利用pBR322质粒插入失活分离带有外源DNA片段的重组克隆的原理是什么？ ① 外源DNA片段插入在pBR322质粒tetr基因的编码序列内（BamH I）位点，使该基因失活； ② 体外重组反应混合物转化大肠杆菌ampstets菌株，并涂布在amp琼脂平板上，凡获得了pBR322质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落；
③ 将amp琼脂上的菌落原位影印在tet琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在amp平板上能够生长而在tet平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离带有外源DNA插入片段的重组体质粒。 8. pUC质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么？
答：pUC系列质粒载体是在pBR322质粒载体基础上改造来的，它用lacZ’ 基因取代了pBR322质粒载体上的tetr基因。lacZ’ 基因编码β-半乳糖苷酶的N末端1-63个氨基酸(α-肽链)的DNA片段, 在lacZ’ 基因内组入了一个多克隆位点（MCS），但不影响lacZ’基因的功能。 pUC载体的宿主（E. coli）携带一个编码β-半乳糖苷酶C端序列的基因片段, 它们本身用这个基因片段产生的β-半乳糖苷酶片段是无活性的, 但它们可以通过α-互补作用在体内相互弥补, 即两部分产物可以结合形成有活性的β-半乳糖苷酶。当pUC质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal和 IPTG的诱导培养基上培养时，菌落成蓝色。如果在MCS插入外源DNA片段（基因），破坏了lacZ’ 基因的功能（插入失活），不再产生α-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是无(白)色的。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。 9．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColE1和pSCl01这两个自然质粒也不尽如人意，通常需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容?
答：基本内容包括：(1) 删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段；削减载体的分子质量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力。
(2) 加上易于选择或检测的标记。
(3) 限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。 (4) 加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。 (5) 安全性改造，限定载体的宿主范围。 10．质粒制备的基本原理？
答：带有质粒的细菌细胞在SDS作用下裂解，并在碱性条件下使DNA变性。调节pH值至中性时，质粒DNA首先复性，而细菌基因组DNA不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体，可以被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。
噬菌体载体
一、填空题
1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：①它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增；②对某些噬菌体（如λ噬菌体）的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传研究的比较详尽。
3．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是没有合适的限制性内切核酸酶识别位点和选择标记。
4．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒，COS位点序列来自λ噬菌体 ，最大的克隆片段达到 45 kb。
8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：① 分子质量大；② 酶的多切点；③ 无选择标记 。
9．M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：① SS→RF ；② RF→RF ；③ RF→SS。
二、选择题(单选或多选)
1．限制性内切核酸酶EcoR I在野生型的入噬菌体DNA中有5个切点，Hind III有7个切点，BamH I也有5个切点。调整这些酶切位点的数量，主要通过( A )。 A．体内突变 B．完全酶切后连接
C. 部分酶切 D．先用甲基化酶修饰后再酶切
2．pBluescript M13载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，下述四种功能中哪一种是不正确的? ( D ) A．可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析 B．利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增
C．利用通用引物进行序列分析 D．利用这两个启动子进行定点突变 3．下面关于细菌人工染色体 (BAC) 的特征描述，除了( C )外都是正确的。 A．通过电激法将大质粒转化到大肠杆菌比酵母的转化率提高了10~100倍 B．BAC载体在细菌中以环形超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易 C．BAC载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
D．克隆到BAC载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列
4．以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会出现大小不一、生长速度不一的现象，其原因是( D )。
A．营养成分不足 B．重组后的质粒复制不稳定 C．重组后的黏粒整合到宿主染色体上 D．重组体中插入片段的大小不同 5．黏粒（Cosmid）是一种人工构建的载体，( AB )。
A．它具有cos位点，因而可进行体外包装 B．它具有质粒DNA的复制特性
C．进入受体细胞后，可引起裂解反应 D．进入受体细胞后，可引起溶原化反应 6．黏粒 (Cosmid) 质粒中，COS位点的功能是 ( C )。
A．复制起点 B．限制酶切位点 C．参与包装进入病毒外壳 D．选择标记 E．用于筛选重组子
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