DNA复制

DNA复制

一． DNA复制的基本规律

（一）半保留复制

1．DNA复制方式可能有三种方式（图） 全保留（conservative） 半保留（semiconservative） 分散（dispersive）

2．沃森—克里克的半保留复制

沃森和克里克在提出DNA双股螺旋模型后，就提出了关于DNA复制学说，即半保留复制；每个子代DNA分子中，一股是新合成的，而另一股则来自其亲代DNA分子，亲代原子的这一分布称为半保留（图）。 3．梅塞尔森—斯塔尔实验（图）

大肠杆菌在含15N（15NH4Cl）的培养基中繁殖多代，使嘧啶和嘌呤硷基中的14N全部被置换为15N，收集大肠杆菌，分离其中的DNA，然后进行CsCl平衡密度梯度离心，这时DNA形成一单独的条带，与对照的DNA(14N)相比，DNA的浮力密度增加，其原因是15N置换了14N。含有15N置换了14N。含有15N的DNA和含有14N的DNA置同一离心管中，进行CsCl平衡密度离心，经紫外吸收检测，形成两条区带。（图）

现在再以在15N氮源中培养的大肠杆菌转移到含14N的培养基中传代，每隔一定的时间取样，分离DNA并进行密度梯度离心，这时，由浮力密度不同所产生的DNA条带显示了规律性变化。繁殖一代，分离得到一条DNA条带。这条带的密度正好介于14N DNA密度和15N密度中间。没有得到15N DNA条带，这表明在复制中亲代DNA不能作为完整的单链保留下来。亦未得到14N DNA，

这表明所有子代DNA分子都是由亲代中获得部分的原子。获得的比例必然是一半，因为杂化DNA条带的密度正好位于14N DNA和15N DNA密度之间。繁殖一代之后，所有DNA分子都杂化了，含有相等数量的14N和15N，亲代DNA(15N)已不存在。繁殖二代后，出现数量相等的两条条带。一是杂化的（14N,15N）的DNA分子，另一条是14N DNA分子。繁殖四代之后，仅出现一条条带（14N）DNA。将0代DNA和第四代DNA相混合进行离心，得到两条条带，一个是N DNA条带（0代），一个是14N DNA条带（四代）。上述实验表明，复制后的DNA是由一条亲代链和一条子代链组成，而复制是半保留方式进行的。这与沃森和克里克的DNA复制模型相符。 （二）复制的方向

在DNA复制过程中，在DNA聚合酶催化下，新加上去的三磷酸脱氧核苷，永远是它的5’位磷酸与DNA链上的3’端的3位羟基缩合，脱去焦磷酸，生成3’磷酸酯键。DNA链的生长端是3’端，它的延长是5’—3’方向进行。

（三）复制的半不连续性 1． 问题的提出

亲代DNA两条链是反平行的，一条链是3’—5’，另一条链是5’—3’。在复制叉处合成两条子代链方向是向复制叉前进方向进行的，所以，以上述两条亲代链为模板分别合成两条子代链的方向则是5’—3’和3’—5’。但已知DNA聚合酶聚合方向均为5’—3’，而没有3’—5’方向，问题如何解决？（图）

2． 冈崎片段与半不连续复制

日本冈崎发现两个子代链合成方式不同。以亲代3’—5’DNA链为模板的子代DNA复制方向是5’—3’，是连续的，这条连续合成的子代链称领头链（leading strand），而以亲代链5’—3’DNA链为模板的子代DNA复制

15

是不连续的，先是5’—3’方向合成一些不连续片段，称作冈崎片段（kazaki fragment），然后再通过连接酶共价连接成一条子代DNA链，这条链称作随从链（lagging strand）。这样，领头链和随从链的冈崎片段均是5’—3’方向合成的。但是随从链整个链进行方向是3’—5’方向。因为一条链是连续合成，另一条链是不连续合成，故称作半不连续合成（semidiscontinuous）。 （四）DNA合成中的起始作用

DNA聚合酶不能起始DNA合成，只能延长已有的引物。引物的作用是启动DNA合成。引物是与模板链互补的短RNA链，是由RNA聚合酶或引物酶合成。每个冈崎片段起始引物都是RNA。

二． DNA复制的酶学

DNA复制是一个复杂的过程。

DNA复制是一个涉及许多酶和蛋白的系统。 重点讨论原核生物DNA复制。

（一）核苷酸的聚合和DNA聚合酶（DNA polymerase） 1.作用机制

DNA聚合酶催化的聚合作用，是以脱氧核苷三磷酸为底物，以亲代DNA链为模板，在引物的3’-OH上逐个聚合。故称依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase,DDDP）（图）。反应条件：4种底物，模板DNA，RNA引物，Mg2+等。 2．DNA聚合酶

1958年，Kornberg从大肠杆菌中发现催化上述反应的酶，称作Kornberg酶。以后，另外两种原核生物DNA聚合酶相继发现，故Kornberg酶就称为DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ),而另外两种称为DNA聚合酶 Ⅱ和Ⅲ；即PolⅡ和PolⅢ。经研究证明，PolⅢ是真正的DNA复制时复制酶（replicase）。

（1）PolⅠ

5’—3’聚合活性 填补缺口：它不是真正的复制酶，而是切除引物RNA后，承担填补其空缺。

3’—5’外切酶活性 校对编辑：从3’端识别和切除不配对的核苷酸，然后链的延长重新开始。

5’—3’ 外切酶活性 修复与切除引物：作用于具切口的双螺旋DNA，并在切口从外的配对区切割，使具5’—端的DNA链降解为单核苷酸，这样除去损伤或错误的配对的DNA，随即聚合酶活性开始，向3’端延伸；也能切引物RNA，说明在DNA复制也是有作用的（图）。

Klenow片段：用胰蛋白酶处理PolⅠ，可得到两个不同的活性片段，较大的C端片段（324—928）具有聚合酶和3’—5’外切酶活性，也称Klenow片段；较小的N端片段（1—323）具有5’—3’外切酶活性（图）。 （2）Pol Ⅱ

5’—3’聚合活性

功能不清 3’—5’外切活性 （3）POL Ⅲ

5’—3’聚合活性 DNA复制 真正的复制酶 3’—5’外切活性 只对单链DNA有作用

DNA聚合酶Ⅲ全酶由多亚基组成，其组成可分四个层次：PolⅢ(Core),核心酶（core enzyme），由 αεθ 组成；Pol Ⅲ’和Pol Ⅲ*及全酶（表）。α亚基具有聚合活性，ε亚基具有3’—5’外切酶活性；θ刺激ε外切酶活性。

（二）引物的合成和引物酶

RNA聚合酶催化转录时，能够从第一个核苷酸起合成新的RNA，但是DNA