DNA复制

聚合酶是否能完成新的DNA合成的起始的。DNA的复制是半不连续的，DNA聚合酶只能从引物的3’—OH端延长，而不能引发DNA的重新合成。引物是什么？噬菌体M13的DNA复制显示对转录抑制剂敏感，从而表明RNA可能提供DNA复制的3’—OH端，也就是说RNA可能是DNA复制的引物。Reiji等用含甲苯的缓冲液处理大肠杆菌以提高对外源核苷酸的通透性，然后大肠杆菌与[α-p]脱氧核苷三磷酸和未标记的核糖核苷三磷酸的混合物保湿，分离DNA和碱处理，发现dNTP上的放射性磷连接在核糖核苷酸上，每一个冈崎片段都产生一个RNA—DNA 接头，从而证明DNA复制是以RNA为引物的。RNA 引物是由RNA聚合酶催化的吗？研究表明，RNA聚合酶不能产生DNA复制的RNA引物而是由引物酶（Primerase）催化合成的（图）。

引物酶与解螺旋酶紧密结合，形成引发体，协调催化解旋和引发反应。 （三）DNA双链的分离和解螺旋酶

复制过程中，亲代DNA 双链要不断分离，为了复制顺利进行，还必须防止解开的单链复性。这个过程是解螺旋酶（helicase）和单链结合蛋白（Single-strand binding protein ,SSB）所承担。

解螺旋酶利用ATP水解的能量使DNA双链分开，并在DNA上沿一定方向移动。生物体内有多种解螺旋酶，有的参与DNA复制，有的参与DNA修复、重组等非复制过程。在大肠杆菌中解螺旋酶有Dna B, PriA和Rep蛋白。在大肠杆菌承担DNA复制解链的解螺旋酶是Dna B蛋白，结合单链DNA，它具有ATP酶活性，利用水解ATP能量沿DNA单链迅速运动，在遇到双链的地方继续沿原来的单链运动，因此将双螺旋DNA 的两条链解开，而且它是参与引物酶结合的。移动的极性是5’—3’方向，而PriA和Rep蛋白沿3’—5’方向移动。随着DNA螺旋逐步解开，单链结合蛋白（single-strand binding protein, SSBP, or SSB）随之结合于单链上，使单链DNA呈伸展的构象，从而使于作为DNA合成的颗粒。SSB结合有协同作用，即SSB的初步结合能

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使随后的结合更加容易。

（四）超螺旋的松弛和拓扑异构酶

超螺旋（supercoil）

●正超螺旋——超螺旋方向与DNA双螺旋一致，加大了分子内部张力，产生紧旋效应，不利DNA 复制和转录。

●负超螺旋——超螺旋方向与DNA双螺旋方向相反，减小分子内部张力，产生松旋效应，有利于复制和转录，天然DNA为负超螺旋。

●复制叉前方产生正超螺旋不利于复制，拓扑异构酶（topoisomerase）的作用是消除这种螺旋，超螺旋的消除与DNA 复制同时进行。复制结束后，这种酶帮助DNA引入超螺旋，使其缠绕、折叠、压缩形成染色质。

TopoⅠ,TopoⅡ,TopoⅢ

TopoⅠ使DNA的一条链断裂和再连接起来，反应不需能量；TopoⅡ使DNA两条链同时断裂和再连接，引入超螺旋时需ATP供能。TOPOⅡ又称旋转酶（gyrase），TopoⅠ和TopoⅡ是DNA复制所必需的，也与染色体的压缩和去压缩有关。

（五）DNA半不连续复制和DNA连接酶

DNA的随从链的复制是不连续的，当冈崎片段形成后，其5’端的RNA通过DNA聚合酶催化的切开移位而降解，为脱氧核糖核苷酸片段而置换，新形成的切口即由DNA连接酶（DNA ligase）预以封闭。

机制：催化DNA的一条链的3’—OH与另一DNA链的5’—P末端形成磷酸二酯键，从而把两段DNA链连接起来。具体如下：

连接酶+ATP 连接酶—AMP + PPi

连接酶—AMP + OH P OH APP O-P 3’ 5’

+ AMP

特点：

（1）不能连接单独存在的两条单链，被连接的两条链必须同另外链互补结合。

5’——————OH P——————3’

（2）不能连接一个豁口（gap），只能连接一个切口（nick）

3’———————5’ 5’——OH P——3’ 无连接作用

（3）双链DNA的两条链都有切口，但切口前后碱基互补配对，也能连接。

功能：DNA复制、修复、重组、剪接

遗传工程是重要工具酶

三． DNA复制过程

（一）复制的起始 1．复制的起始位点与方向

复制起始是指参与复制的蛋白质识别复制起点，合成引物，形成活性的引物—模板复合物，并按碱基配对原则加上第一个核苷酸。

（1）DNA复制是以一个单位进行的，这个单位称复制子（replicon）。在复制子中，总有一个固定的起点启动DNA复制，这个固定的起点称起点（origin ,Ori），通常从起点开始向两个方向复制，这样两个链解开，形成眼睛形的复制眼，复制眼的两个眼角形成两个复制叉（replication fork）。每个复制子的复制结束处即为复制终点（terminus）。因此，从复制起点到复制终点构成一个复制单位，即复制子。复制起点富含A-T序列，比富含G-C

序列易解链。

原核生物只有一个复制起点和一个复制终点，因此，只形成一个复制子，其复制中间产物在放射自显影图上呈Q形，故称“Q形复制”（图）。

真核生物DNA是线性的，它不同于原核生物的是有多个复制起点，因此有多个复制子。在复制时，当相临的两个复制子的眼角碰到一起，两个复制子连接在一起。同样，当许多复制子连在一起时，完成整个DNA复制。 2．引发体的生成

（1）Dna A蛋白的形成起始开放复合物：dna A基因编码的Dna A蛋白结合到起点（ori C），形成开放复合物。这个起点富含A-T，在消耗ATP情况下，使这一区域解链。

（2）预引发复合物的形成：dna B基因编码的Dna B蛋白，即解旋酶结合到开放复合物的每一条单链上，在dna C基因编码的Dna C蛋白和ATP参与下，将Dna B蛋白运送到指定位置，形成预引发复合物；当双链解开一定长度，Dna B蛋白和Dna C蛋白将Dna A蛋白置换出。 （3）SSB结合到单链DNA上。

（4）引物酶也进入上述复合物中。这样，由解旋酶（Dna B蛋白）、引物酶（Dna G蛋白）、Dna C蛋白和DNA的起始复制区等拼成了复合体称作引发体。 3．引物的合成

引发体的蛋白质部分在DNA链上可以移动，并由ATP供应能量。引发体到达适当位置就可按照模板的配对序列，催化NTP(不是dNTP)的聚合，生成引物。

DNA复制中，一条链是可以连续进行的，称领头链（leading strand），另一条链是不连续复制的，这条链是随从链（lagging strand）。在不连续复制的链上，引发体需多次生成，但生成过程比上述的简单些。

引物长度为十余个至数十个核苷酸不等。引物合成方向也是5’—3’。