65?50050所以：酶的回收百分率=总活力2/总活力1=?93% 14?16003265比活力250酶的提纯倍数???3(倍)
比活力11432 13、确定一个酶催化反应的Vmax的困难之一需要很高的底物才能使本科完全饱和，需要多大的底物浓离（以Km的倍数表示）才能得到初速度的0.75Vmax、0.9 Vmax、0.95 Vmax和Vmax？
解析：
当V=0.75 Vmax时，由米氏方程V?则[S]=3Km
Vmax[S]V[S] 可得:0.75Vmax?maxKm?[S]Km?[S]Vmax[S]则[S]?9KmKm?[S]V[S] 当V?0.95Vmax时,有方程:0.95Vmax?max?19KmKm?[S]V[S][S]1当V?Vmaz时,有方程:Vmax?max,即?1,则?1KmKm?[S]Km?[S]?1[S]当V?0.9Vmax时,有方程:0.9Vmaz?由于Km为酶的特征常数，不可能为0，所以要使本式成立，则需
Km?0,所[S]以[S]→∞
从上面结果可以看出，只有当底物浓度足够大，才能使酶促反应的反应速度达到最大值。
答案：3 Km、9 Km、19 Km、无穷大。
14、简述酶具有高催化效率的因素。
解析：本题考点：影响酶促反应的因素。
酶是专一性强，催化效率很高的生物催化剂，这是由酶分子的特殊结构决定的，经过多种途径的研究，发现有许多因素可以使酶反应加速。
（1）邻近和定向效应：可以说酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程，在这一过程中包括两种效应：邻近效应和定位效应。邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应；定向效应则是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。
（2）分子张力和扭曲：当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可
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以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应的活化能，使反应易于发生。
（3）酸碱催化：酸碱催化则通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子经稳定过渡态，来加速反应。
（4）共价催化：共价催化在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或吸取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间化合物，降低反应活化能，使反应加速。
（5）低介电子环境的影响：酶分子活性中心穴内相对地说是非极性的，极性的水分子被排斥到穴外，这样，酶的催化基因处于低介电环境中。由于没有水分子的屏蔽作用，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就容易发生反应，加速了催化反应的进行。
上述实现酶反应高效率的五个重要因素，其中最主要的可能是酶与底物结合时，两者构象的改变使它们互相契合，底物分子适当地向酶分子活性中心靠近，并且趋向于本科的催化部位，使活性中心这一局部地区的底物浓度大大增高，并使底物分子发生扭曲，易于断裂。其他因素在不同的本科促反应中的作用可能各有偏重。如胰凝乳蛋白酶催化剂特定肽键水解时，起主要作用的是形成酰化共价中间产物和广义酸碱催化。
15、举例说明别构效应的生物学意义。
答案：别构效应是指生物体内具有多个亚基的蛋白质与别构效应剂结合后而引起其构象的改变，从而导致蛋白质分子生物活性大小改变的现象。
例如：血红蛋白分子是由四个亚基（α2β2）组成的蛋白质。脱氧血红蛋白分子由于分子内形成了八对盐键，使其构象受到约束，构象稳定，和氧的亲和力较弱。当一个α-亚基与O2结合后，部分盐键被破坏，某些氨基酸残基发生位移，这时与氧的结合位点随即暴露出来，使第二个α-亚基构象改变，对氧的亲和力增加而与氧结合，这样又可以使两个β-亚基依次发生构象改变而以更高的亲和力与氧结合，这时八对盐键已经全部断裂，α1β1和α2β2之间的位移也达到7A0，血红蛋白分子的变构作用使得整个分子以很快的速度与全部四个氧原子完全结合，从而提高血红蛋白的携氧功能。
16、为什么His常被选择作为酶分子中的活性中心的构成成分而并不作为蛋白质的一般结构成分。
答案：原因有二：一是在生理条件下，His的咪唑基有一半解离，它既可作为质子供体，又可作为质子受体在酶促反应中发挥催化作用；二是His上的咪唑基供出质子或接受质子的速度十分迅速。
17、举例说明酶活性调节的几种主要方式。
答案：①别构效应的调节，如ATCase；②可逆共价修饰的调节，如糖原磷酸化酶；③酶原的激活，例：一系列作用于消化过程的蛋白酶原；④激促蛋白质和抑促蛋白质的调控，如钙调蛋白等。
18、何谓竞争性和非竞争性抑制作用，根据米氏学说原理推导，分析其抑制作用动力学。
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答案：竞争性抑制作用：竞争性抑制剂（Ⅰ）具有底物（S）相类似的结构，它与底物竞争酶（E）的活性部位，从而影响了底物和酶的正常结合，而酶的活性部位不能同时既和底物又和抑制剂结合，这样抑制剂和底物之间超着竞争作用使反应速度下降。当系统中有这种抑制剂存在时，酶便与抑制剂结合形成EI复合物，该复合物不能分解为产物，使反应速度下降。
根据米氏学说原理可推导出反应速度（V），底物浓度[S]和抑制剂浓度[I]之间的关系为：
V?Vmax[S],加入竞争性抑制剂后,Vmax不变,Km变大。
[I]Km(1?)?[S]Ki非竞争性抑制作用：非竞争性抑制剂可以和酶活性中心以外的部位结合，且不妨碍酶与底物的结合，底物和抑制剂之间没有竞争关系，这样就可形成酶、抑制剂、底物三者的复合物EIS，但这种复合物不能进一步转变为产物，致使反应速度下降。
根据米氏学说原理，可推导出速度、底物浓度和抑制剂浓度之间的关系为：
V?Vmax[S],加入非竞争性抑制剂后,Vmax减小,Km不变。
[I]1?(Km?[S]Ki
19、对于某一个酶有两个底物a和b，如何判断哪一个是该酶的最适底物。请说明判断的原理和实验设计。
答案：分别测定两个底物的米氏常数，米氏常数小的底物是最适底物。其原理是根据方程：
K111 ?m??VVmax[S]Vmax
20、提纯醇脱氢酶，用55%饱和度的硫酸铵沉淀。沉淀溶解于水中，其蛋白质浓度为1.5g/L，500倍稀释后，取10μ1酶溶液测定活性（总体积为3.0ml的pH9.2的缓冲液中，用过量的乙醇和NAD+，测定在340nm光吸收变化），初速度为0.11OD单位/min。硫酸铵沉淀后上清液的蛋白质浓度为2.0g/L，1000倍稀释后也取10μ1溶液按上述方法测活，初速度为0.08OD单位/min。计算二个组分的比活性。（ε340（NADH-NAD）+）=6.2×103/mol/L）。请你对该提纯步骤作出评价。上述的实验是否有不足之处？如果有，请你指出。
答案：标准的酶活力单位U以μmol/min表示，用初速度除以ε340，乘以稀释倍数和测活力时体积比（10μl至3ml），即为样品中的酶活力，沉淀溶解液和硫酸铵沉淀后上清液的酶活力分别为0.11×500×300/6.2=2661和0.08×100×300/6.2=3871U/ml。比活的单位是U/mg蛋白质，由此可求得沉淀溶解液和硫酸铵沉淀后的上清液以比活分别为1774和1936U/mg。
根据活力测定，可认为55%饱和度的硫酸铵沉淀，并没有达到更高酶的比活，即纯化实验是失败的，而且在所得的两个级分中酶的含量几乎相当，沉淀后的上清液中略多些，这一实验的设计比较粗糙，应该使用分级沉淀的方法，例如可先用
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30%饱和度的硫酸铵沉淀，再在上清液中加固体硫酸铵，提记硫酸铵的浓度到65%。更为合适的方法是进行预试验，分别取和20%、20%～40%、40%～65%不同饱和度的学沉淀，对各级分别测定酶的比活，根据不同级的比活再修改沉淀所用的硫酸铵的饱和度。
21、化学修饰结果表明，某个酶的Lys-274可能是其底物结合必需基团，请试用点突变方法，设计实验进一步证明之（只要求写出大致步骤）。
答案：实验点突变方法，改变Lys-274为Ala，然后用基因工程的方法，表达突变后的酶蛋白，在分离得到突变以后的酶蛋白，在证明突变后的酶蛋白的二级结构没有明显改变的前提下，测定突变酶蛋白的米氏常数，如米氏常数变大，则可作为Lys-274为底物结合必基因的又一证据。 22、从漂白过的面粉中有时可分离到一种甲硫氨酸衍生物——甲硫氨酸亚砜亚铵（methionine sulfoximine），它的结构如下：
NH ‖ O = S CH2 CH2 CH3 H C NH3 + COO- O 它可引起机体抽搐，是谷氨酰胺合成酶的强烈抑制剂。请提出这一抑‖ CH3 S = NH 制可能的作用机制？
（甲硫氨酸亚 砜亚胺与谷氨酸的差异仅在γ位一个是甲基亚砜亚胺
O ‖ 一个是羧基，甲C OH 硫氨酸亚砜亚胺经酶催化转变为甲硫氨酸亚砜亚胺磷酸，后者与谷氨酰胺合成酶结合牢固）。
23、1μg纯酶（MW为9200），在最适条件下，催化反应速度为0.5μmol/min。计算：⑴酶的比活力（U/mg蛋白质）；⑵转换数（TN值）。 答案：⑴∵V=0.5μmol/min ∴活力单位：0.5U
酶的比活力=0.5/1×10-3=0.5×103U/mg
⑵转换数（TN值）:0.5μmol/60秒=0.0083μmol/秒 24、某酶制剂的比活力为42U/mg蛋白，每毫升含12mg蛋白质。
⑴计算1mL反应液中含5μl酶制剂时的反应初速度。 ⑵计算1mL反应液内含5μl酶制剂，在10分钟内消耗底物多少？为保证测定酶的初速度，所需要的最低底物浓度是多少？ 答案：⑴5μl含活力单位：5/103×42×12=2.52U
由活力单位定义可知: 反应初速度=2.52μmol/mL.min
⑵10min消耗的底物:2.52μmol/mL.min×10min=25.2μmol/mL 为保证测定酶的初速度，底物消耗要低于5%:2.52×10-2/0.05=0.504mol/L
第六章 维生素和辅酶
1、为什么人体、猴和豚鼠必须从食物中获得抗坏血酸；而大鼠、小鼠、犬、兔等不需从食物中获得抗坏血酸？ 2、解释：NAD、NADP、FMN、FAD。 3、维生素B6和转氨作用有什么联系？ 4、四氢叶酸在代谢中有什么作用？
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