转染详细步骤大攻略

转染详细步骤大攻略

范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达

按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/μl。将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。具体操作步骤如下：

1）质粒准备

按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：

(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）

(3)向离心管中加入200μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）

(4)向离心管中加入250μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）

(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。

(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。

(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。

(8)加入600μl结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min,倒掉收集管中得废液。（如果一次加不完可分两次加）

(9)向吸附柱中加入700μl漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中。

(10)向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中。

(11) 12000rpm离心2 min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中得乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。

（12）将吸附柱放入一干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50μl -200μl经65℃水浴预热的无内毒素洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。

（12）为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心1min。

将得到的去内毒素的真核表达质粒测定质粒浓度，分装标记后，4℃保存备用。

2) 细胞培养与接种

将A549细胞培养于含10%胎牛血清FBS、含双抗（100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）的1640(Solarbio)培养基中,于 37℃、5% CO3培养箱中培养。待细胞密度大约70%-80%时，吸去培养瓶内的旧培养液。用无菌PBS缓冲液（0.4g KCl，0.4g KH2PO4，16g NaCl，3.12g Na2HPO4﹒7H2O，融解在2 L双蒸水中）漂洗细胞两次，吸去漂洗液。将1mL胰酶（37℃水浴）加入培养瓶中，消化2-5min于显微镜下观察至细胞变圆后倒掉，吸去残留胰酶，加入3ml完全培养基，轻轻吹打瓶壁细胞（尽量避免大量气泡产生），使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。用移液枪吸取100ul吹打后的细胞悬液于EP管中，加入900ul培养基与之混合，混合均匀后取10ul沿盖玻片的边缘滴加到细胞计数板上，置于显微镜下观察并计算细胞接种密度。铺板后置于显微镜下观察，轻轻晃动培养板使之细胞分散均匀，室温放置片刻放入培养箱中培养。

3) 细胞转染

以下转染操作以12孔板为例。转染全过程于细胞间严格无菌操作。

(1)转染前一天，胰酶消化细胞并计数（使其在大约24小时后转染前密度达到90%左右为宜），将细胞铺板在1ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 (2)对于每孔细胞，使用100μl无血清培养基（1640基础培养基）稀释1.6μg 质粒，轻轻混匀后于室温放置5min。

(3) 对于每孔细胞，使用100μl 无血清培养基（1640基础培养基）稀释4μl Lipofectamine 2000试剂。轻轻混匀后于室温放置5min。

(4)将步骤2和步骤3的溶液混合，轻轻混匀后于室温静置20min。

(5)同时，将12孔板中的细胞用PBS冲洗细胞一遍后，再用无血清培养基（1640基础培养基）冲洗一遍后，加入1 ml无血清培养基。

(6)将步骤4的复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。置于37℃，5%CO2培养箱中培养6h。

(7)6h后，将无血清培养基更换为含有血清的培养基（即10%胎牛血清+90% 1640基础培养基），继续孵育24－96小时于荧光显微镜下检测结果。