学位论文4 - 图文

徐州医学院硕士论文

GAPDH 1.3 主要仪器 PCR仪 电泳仪 普通离心机

GGGAAACTGTGGCGTGAT GAGTGGGTGTCGCTGTTGA

Eppendorf公司 北京六一仪器厂 北京医用离心机厂 德国Heraeus公司 苏净集团安泰公司 美国UVP公司 上海跃进医疗仪器厂

岛津,UV-1601PC 上海医疗仪器厂 日本SANYO公司 北京六一仪器厂 日本OLYMPUS公司 瑞士Mettler公司 瑞士Mettler公司 上海力康公司 日本SANYO公司

美国Thermo scientific 公司

美国ABI公司

低温高速离心机 超净工作台 UVP凝胶成像系统 恒温水浴加热器 紫外可见分光光度计 恒温培养箱 -80℃冰箱 H6-1微型电泳槽 荧光显微镜

Mettler AT261电子天平 PHS-3型酸度计 CO2细胞培养箱 SIM-F123制冰机 台式恒温摇床

荧光定量PCR仪（7500）

1.4 主要试剂的配制

1.4.1 无核酶水：999 mL 去离子水，加入1 mL 焦碳酸二乙酯，充分混匀后常温放置48 h，121 ℃ 高压灭菌20 min，高压灭菌后分装备用。

1.4.2 75% 乙醇：取无水乙醇75 mL，加入25 mL 无核酶水，混匀后分装备用。 1.4.3 5×TBE电泳缓冲液：

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Tris碱 硼酸

54.0 g 27.5 g 20 mL

0.5 mol/L EDTA 定容至1000 mL。

1.4.4 10×TE缓冲液：称取Tris碱12.11 g，EDTA 2.92 g，溶于950 mL去离子水中，1 mol/L的HCl调节PH值至8.0，定容至1000 mL。使用时稀释10倍高压灭菌，分装备用。

1.4.5 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液：

称取0.25 g胰蛋白酶溶于99 mL冰浴的1×PBS溶液，加入1 mL 2% EDTA溶液，玻璃棒轻柔搅拌充分溶解，避免产生气泡，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存。

1.4.6 PBS缓冲液的配制：

称取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，NaH2PO4 1.44 g，K2HPO4 0.24 g，经800 mL双蒸水溶解，HCl调节溶液的pH至7.4，双蒸水定容至1 L，高压灭菌, 室温保存。 1.4.7 Western-blot中所用试剂 1.4.7.1 PAGE胶的母液

（1） 1.5 M Tris-HCl：Tris 36.3 g加双蒸水溶解调pH值至8.9，定容至200 mL，4℃

保存；

（2） 0.5 M Tris-HCl：Tris 1.495 g加双蒸水溶解调pH值至6.8，定容至25 mL，4℃

保存；

（3） Acr-Bis：Acr 30 g、Bis 0.92 g分别用双蒸水溶解，混合定容至100 mL过滤，

4 ℃保存；

（4） 10% SDS：SDS 4.0 g加双蒸水定容至40 mL，50 ℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后仍可使用。

（5） 40%蔗糖：蔗糖10 g加双蒸水定容至25 mL，4 ℃保存；

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（6） 10%过硫酸胺 (AP)：过硫酸胺0.1 g经双蒸水1.0 mL溶解后，置于4 ℃保

存，保存时间为1周。 1.4.7.2 分离胶和浓缩胶的配制：

成分 10%分离胶(mL) 5%浓缩胶(mL) Tris－HCl（1.5M, PH 8.9） 2 — Tris－HCl（0.5M, PH 6.9） — 1 Acr- Bis 2.67 0.53 10% SDS 0.08 0.04 40% 蔗糖 — 1.2 ddH2O 3.25 1.23 TEMED 0.004 0.004 10％ AP 0.04 0.02 注：先将前六种试剂混匀，再加入促凝剂10% AP和TEMED，并快速混匀加入到制胶的模板内。

1.4.7.3 转印缓冲液 （1000 mL、PH 8.3~8.8、不调PH、4 ℃保存、用时复温）

组分 Tris Gly SDS CH3OH

用 量 5.8 g 2.9 g 0.37 g 200 mL

注：各组分加双蒸水混匀后，加入双蒸水定容至1000 mL。 1.4.7.4 Washing buffer（1000 mL、PH 7.5、调节PH、4℃保存、用时复温）

组 分 Tris NaCl

用 量 1.21 g 5.84 g

终浓度 10 mM 100 mM

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Tween-20 1 mL 0.1 %

注：各组分加双蒸水混匀后，定容至1000 mL。

1.4.7.5 电极液 （1000 mL、PH 8.3-8.8、不调PH、室温保存）

组分 Tris Gly SDS

用 量 3.025 g 18.75 g 1.0 g

终浓度 10 mM 100 mM 0.1 %

注：各组分加双蒸水混匀后，定容至1000 mL。

1.4.7.6 2×加样缓冲液

0.5 mol/L Tris-HCL (PH 6.8) 10%SDS β-巯基乙醇 甘 油 1%溴酚蓝 总体积

2 mL 4 mL 1 mL 2 mL 1 mL 10 mL

1.4.7.7 BSA封闭液：取1 g BSA加入20 mL Washing buffer混匀，调节PH 7.5，

4 ℃保存、用时复温。

1.4.7.8 一抗、二抗稀释液(10 mL)：3.33 mL的封闭液＋6.67 mL的Washing buffer。 1.4.8 免疫荧光所用试剂的配制

1.4.8.1 抗体稀释液：取0.4 g BSA，4 mL10× PBS缓冲液加入36 mL双蒸水中搅

拌，再加入120 uL TritonX-100混匀，4℃保存，用时复温。

1.4.8.2 抗体封闭液：取1.5 g BSA，5 mL10× PBS缓冲液加入45 mL双蒸水中搅

拌，再加入150 uL TritonX-100，终浓度为0.1%叠氮钠混匀，4℃保存，用时复温。

1.4.8.3 4%甲醛溶液：取40%甲醛溶液5 mL加入45 mL PBS缓冲液中搅拌混匀，

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