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4℃保存。
2 方法
2.1 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的获得、培养与鉴定
取新鲜脐带，无菌操作下胶原酶灌注消化获取 HUVEC，将 HUVEC 悬液接种于人纤维连接蛋白（FibronectinFN）处理后的培养瓶中，使用 EGM-2 完全培养基培养，VE-Cadherin 免疫荧光染色鉴定 HUVEC。获得的HUVEC置于37℃，5% CO2，细胞培养箱中培养，每2-3天换液一次，待细胞融合度达95%时以0.25%胰蛋白酶-0.02íTA消化液消化细胞，以1∶2传代。VE-Cadherin免疫荧光染色鉴定HUVEC。 2.2 实验分组与药物干预
取长势良好的HUVEC，接种于FN处理的24孔板或无菌培养瓶中，待细胞生长至融合度为90%-95%时，加入长春瑞滨浓度为0.05ug/ml 的EGM-2培养基，共同培养1h后，PBS洗涤，换入新鲜培养基继续培养0、6、12小时，RT-PCR以及荧光定量PCR检测TLR4的转录情况；Western Blot检测TLR4蛋白表达情况；免疫荧光检测NF-κB的核转位情况。 2.3 荧光定量 PCR检测TLR4 mRNA的表达水平 2.3.1 提取总RNA，具体步骤依照Trizol说明书进行：
（1） 收集细胞约10个；
（2） 加入Trizol 1 mL，吹打均匀；
（3） 将均相移至无核酶EP管中，室温或冰浴放置5 min； （4） 加入200 μL氯仿，剧烈震荡混匀后静止10 min；
（5） 4 ℃、12000 g离心10 min，吸取上层水相置于一无核酶EP管中，加等体
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积异丙醇，颠倒混匀，室温静止10 min；
（6） 4 ℃、12000 g离心10 min，见管底少量白色沉淀； （7） 弃上清，加入75%乙醇1 mL，颠倒混匀洗涤RNA沉淀；
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（8） 4 ℃、12000 g离心10 min，弃上清，风干EP管； （9） 加入20 μL无核酶水溶解RNA沉淀，置于-80 ℃保存。
2.3.2 反转录获得HUVEC cDNA
使用Oligo dT18引物，M-MLV反转录酶反转录得HUVEC cDNA，反应过程如下：
（1） 将1 μL oligo dT，5 μL 总RNA，1 μL 10mM dNTP Mix，5 μL ddH2O 加入
无核酶PCR管中；
（2） 混匀后于PCR仪上65 ℃ 5 min后迅速置于冰上；瞬时离心后加入4 μL
5×First-Strand Buffer，2 μL 0.1 M DTT，1 μL RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor；
（3） 加入1 μL M-MLV反转录酶，颠倒混匀，瞬时离心； （4） 37 ℃反应50 min后70 ℃15 min中止反应。 （5） 所获得的cDNA置于-20 ℃保存。
2.3.3 荧光定量PCR检测TLR4基因的表达水平
使用Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG荧光定量PCR试剂盒检测各组细胞TLR4的表达。标准品由本实验室保存。反应体系如下：
反应体系如下：
Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG Forward primer，10 μM Reverse primer，10 μM ROX Reference Dye cDNA 50 mmol MgCl2 ddH2O Total volume
12.5 μl
1 μl 1 μl 0.1 μl
1 μl 0.75 μl 8.65 μl
25 μl
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反应条件为：
（1）TLR4：50 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min, 继之94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 1 min，
共35个循环， 72 ℃ 终末延伸10 min。
（2）GAPDH：50 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min, 继之94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 1
min，共35个循环， 72 ℃ 终末延伸10 min。
2.3.4 荧光定量PCR结果分析
PCR反应采用美国ABI公司7500型荧光定量PCR仪完成，由电脑自动分析结果，计算Ct值。基因相对表达量用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt = [目的基因的平均Ct值(样本组)-管家基因的平均Ct值(样本组)]-[目的基因的平均Ct值(校正组)-管家基因的平均Ct值(校正组)]。Ct 值的定义：C 代表Cycle，t代表 threshold，Ct值的含义：每个反应管内荧光强度达到系统认为的有目的DNA合成时的循环数。以GAPDH表达水平做为内部参照，分析各组基因表达水平的变化。 2.4 Western-blot检测HUVEC TLR4蛋白的表达 2.4.1 细胞的收集与处理
PBS洗涤细胞一遍，使用细胞刮将其收集至EP管中，按细胞体积的20倍加入裂解液（其中按1:100加入ProteoBlock pic），振荡器1000 r/min室温震荡裂解细胞10 min，20000 g/min离心15 min，转移上清至新的EP管中，1:1体积加入2×上样缓冲液，混匀后沸水浴10 min，-20℃保存备用。 2.4.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
（1） 安装垂直电泳装置：按照厂方说明书进行；
（2） 灌注分离胶：配制10% 分离胶，小心的沿电泳装置一侧注入玻璃板间隙（上
留空间为梳齿长度+1 cm），以双蒸水封顶，待分离胶完全聚合后倾倒出覆层液体，用双蒸水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，用吸水纸吸尽残留液体；
（3） 灌注浓缩胶：配制5%浓缩胶，注入玻璃板内分离胶的上部空间，尽量不要
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产生气泡，小心插入梳子，待浓缩胶完全聚合后拔出梳子；
（4） 样品上样：将凝胶固定于蛋白电泳槽内，加入电极液，排出凝胶底部玻璃板
之间的气泡和未聚合的丙烯酰胺；加样前先将样品蛋白在沸水中煮沸片刻使蛋白质充分复温，小心按预定顺序加样（每孔加入100 μg总蛋白）；
（5） 电泳：将电泳槽与转移电泳仪相连，凝胶初始所加电压为10 V/cm（100 V），
当样品电泳至浓缩胶和分离胶交界处（约需要20 min），将电压调整为20 V/cm（200 V），继续电泳直至溴酚蓝到达底部时停止电泳，关闭电源卸下玻璃板，取出分离胶。
2.4.3 蛋白质转膜（按槽转印方式转膜）
（1） 准备2.0 cm×8.0 cm的硝酸纤维素膜（NC膜）2张及相应大小的滤纸2
块，将NC膜一角切掉做好标记；
（2） 将NC膜和滤纸浸入湿转电泳缓冲液中30 min，NC膜光面朝上。 （3） 裁剪分离胶（距分离胶和浓缩胶交界线0.5 cm处裁2 cm），按照（阳极）
滤纸—NC膜—凝胶—滤纸（阴极）的顺序逐层安装湿转电泳转移装置，注意尽量排除每层之间所有气泡。
（4） 将电转仪与电源连接，100 V电压转膜1.5 h。
2.4.4 Western-blot检测HUVEC TLR4蛋白
（1） 取出NC膜放入平皿中，加入封闭液10 mL，置于脱色摇床上室温摇晃
孵育1小时（或者放置于4℃过夜）；
（2） 回收封闭液，按蛋白Marker在约55 KD处将NC膜裁开，分别加入相应
的一抗，4 ℃过夜摇床缓慢摇动孵育过夜；
（3） 回收一抗，分别加入Washing buffer 15 mL振摇洗涤（5 min×3次），分
别加入碱性磷酸酶标记的二抗，常温下摇床摇动孵育2小时；
（4） 回收二抗，加入Washing buffer 15 mL振摇洗涤（3 min×5次），ddH2O 15
mL振摇洗涤5 min；
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