徐州医学院硕士论文
（5） 弃ddH2O，加入BCIP/NBT SOLUTION 1 mL，常温显色，出现满意条带
后立刻将NC膜置入ddH2O中终止反应。取出晾干、拍照保存。
2.5 免疫荧光检测NF-κB p65的核转位情况
免疫荧光具体步骤如下：
（1）用PBS稍加润洗。
（2）吸去PBS，将细胞泡在2-3mm厚的4％甲醛溶液(PBS配制)中。 （3）室温下固定细胞15分钟。
（4）吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次5分钟。
（5）甲醇打孔步骤：在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰甲醇中，-20℃孵育10
分钟。
（6）用PBS润洗5分钟。
（7）继续下面免疫染色步骤（以下步骤在避光湿盒中进行） （8）将样品在封闭液中封闭60分钟。
（9）封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。 （10）吸去封闭液，加入稀释的一抗。 （11）4℃孵育过夜。
（12）用PBS润洗3次，每次5分钟。
（13）把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中，加二抗在室温下避光孵育
1-2小时。
（14）PBS润洗切片。 （15）DAPI孵育15-30分钟。 （16）PBS润洗2次
（17）立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。若长
期保存，将玻片放在4℃ 避光保存。
2.6 统计学处理
使用SPSS16.0软件包处理，定量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
26
_
徐州医学院硕士论文
结 果
1 人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定
正常HUVEC呈上皮样贴壁生长，铺路石状镶嵌排列。细胞为梭形，细胞核轮廓清晰，细胞核可见，胞浆丰富。VE-Cadherin免疫荧光染色鉴定的结果为阳性，证实培养的为人脐静脉内皮细胞（图4）。选择10代以内，生长旺盛、形态良好的细胞用于实验。
2长春瑞滨对人脐静脉内皮细胞形态学改变的影响
正常对照组HUVEC呈上皮样贴壁生长，铺路石状镶嵌排列。细胞为梭形，细胞核可见，胞浆丰富。0.05 mg/LVIN处理1h后细胞拉伸，延展，形态不规则，边界不清，排列紊乱，部分细胞悬浮脱落。洗去VIN继续培养6h、12h后，细胞形态逐渐恢复正常（图5）。
3 长春瑞滨对人脐静脉内皮细胞TLR4 mRNA的表达的影响
荧光定量PCR法检测各组细胞TLR4基因表达水平，结果显示：与空白对照组相比，0h组、6h组、12h组表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中0h组升高幅度最大，与6h组、12h组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；6h组表达水平较12h组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），TLR4基因表达水平随时间的递增而呈递减趋势（图6）。
4 长春瑞滨对人脐静脉内皮细胞TLR4蛋白的表达的影响
Western-blot检测各组细胞TLR4蛋白表达水平，结果显示：与空白对照组相比，0h组、6h组、12h组表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中12h组升高幅度最大， TLR4蛋白表达水平随时间的递增而呈递增趋势（表3，图7）。 5 长春瑞滨对人脐静脉内皮细胞NF-κB p65核转位的影响
免疫荧光检测各组细胞NF-κB p65的核转位情况，结果显示：与空白对照组相
27
徐州医学院硕士论文
比，0h组、6h组、12h组的核转位率均有升高，其中0h组、6h组升高幅度较大，差异有统计学意义（P＜0.05），NF-κB的核转位率随时间的递增而呈递减趋势（图7）。
28
徐州医学院硕士论文
讨 论
药物性静脉炎是临床常见的药源性疾病之一，其发病率高，常给患者造成很多不必要的生理、心理痛苦和医疗支出。其中有1/ 3 可能因此导致新的并发症、增加更多药物的治疗，造成患者住院时间延长，甚至影响化疗方案的顺利进行
[47-50]
，在一定程度上限制了一些药物的临床应用。虽然临床工作者通过一些防护
措施可以减少静脉炎的发生，但由于长春瑞滨是中度发疱剂，静脉注射时静脉炎的发生仍不可避免。时至今日，药物性静脉炎发生的确切机制仍不清楚，国内外资料仍缺乏对该类静脉炎机制深入的系统性研究。
近年来TLRs在机体免疫应答中的作用受到高度关注。TLR4作为TLRs大家族的一员，是一种跨膜信号传递的模式识别受体，参与识别病原体相关分子模式，是联系固有免疫和适应性免疫应答的关键分子。它由胞外功能区、跨膜区及细胞内的TIR区域( Toll-interleukin 1 receptor region，TIR)三部分组成。胞外功能区由富含亮氨酸的重复单位组成；胞内的TIR区域有一段与IL-1受体高度同源的保守序列，约含160个功能性氨基酸序列，可与下游衔接蛋白作用，活化信号通路，激发促炎症因子的释放。
TLR4介导的信号途径，包括MyD88 依赖性和MyD88 非依赖性途径。MyD88 依赖性途径主要是介导NF-κB活化和细胞因子产生。MyD88是一种接头分子，TLR4上的TIR结构域与MyD88蛋白羧基端相互作用使其活化，活化的MyD88可诱导IL-1受体相关激酶磷酸化，进而激活胞质内的肿瘤坏死因子受体相关因子6，活化后的TRAF6通过转化生长因子TGF-β活化激酶与IKK信号级联，使IKB磷酸化而降解，从而使NF-κB游离并移位到细胞核中，结合到靶向的DNA，促使TNF-α及IL-1、6、8、12等多种炎症基因的转录[51-53]。另外，还存在MyD88非依赖的信号通路，LPS可以刺激MyD88缺陷的巨噬细胞表达干扰素诱导蛋白10，表达干扰素诱导基因需要依赖TLR4，但不依赖MyD88，而是通过干扰素调节因子3和NF-κB发生的。
29
相关推荐：
loading