实验3淀粉酶最适温度及温度耐受性的确定

实验三 α－淀粉酶最适温度以及耐受性的测定

一、实验目的：

通过测定α－淀粉酶最适温度及其耐受性的实验，使学生掌握酶活力的测定方法，同时熟悉分光光度计的使用方法。

二、实验原理：

α－淀粉酶水解淀粉的产物为还原糖，用比色法测定还原糖的生成量可计算酶活力单位，其定义：1min内水解淀粉所产生的还原糖相当于1umol麦芽糖的酶量，为一个活力单位。

三、实验步骤：

1. 取8支干净的试管，编号：1.空白；2.样品；3.标空；4.标准。在25℃恒温条件下按下表顺序进行操作。

步 骤 加底物溶液（ml） 加双蒸水（ml） 加酶液（ml）摇匀 1 1 1 0 2 1 0 1 3 0 2 0 4 0 0 0 40℃、60℃、80℃、100℃准确保温3min

DNS显色剂（ml） 标准麦芽糖溶液（ml） 2 0 2 0 2 0 2 2 沸水浴3min，冷却

双蒸水（ml） 20 20 20 20 摇匀，在分光光度计上测A540nm

2.计算α－淀粉酶作用的最适温度

酶活力（U/mg）=(A样—A空)*标准麦芽糖的微摩尔数/(A标—A标空)*3*样品管中酶的毫克数

3. 在最适温度下，将待测样品液10ml分别放置在100℃、80℃、60℃、

40℃不同温度下保温30min。再将待测样品放置在最适温度下，按照1中的方法测不同温度保温之后的酶活力。绘制相对活力曲线图。

四、仪器和试剂

1． 2． 3． 4．

分光光度计、恒温水浴锅、温度计、试管、移液管、天平、容量瓶 待测样品液的准备：准确称取1g，用磷酸盐缓冲液定容至100ml 配制底物溶液：称取可溶性淀粉1g，用磷酸盐缓冲液定容至100ml 磷酸盐缓冲溶液：

准确称取0.2mol/LNa2HPO4 3.72g，NaH2PO4 12.42g，NaCl0.372g，用蒸馏水充分溶解后，定容至1000ml，即为20mmol/L磷酸盐缓冲溶液。 5．

配制显色剂3，5－二硝基水杨酸试剂：

准确称取3，5－二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。若溶液混浊可过滤后使用。 6．

配制标准麦芽糖溶液：0.342g分析麦芽糖溶于蒸馏水，定容至1000ml，即为1umol/ml的标准溶液。