激光扫描共聚焦显微镜在光电材料中的应用

激光扫描共聚焦显微镜在光电材料中的应用

涂真珍， 王韦刚

【摘 要】随着自然科学的发展，除了医学和生物研究领域，激光扫描共聚焦荧光显微镜（laser scanning confocal microscopy, LSCM）在材料科学研究中的作用越来越显现出来，特别在光电材料的研究中具有广泛的应用。结合多年的仪器管理和使用经验，以本学院的奥林巴斯激光扫描共聚焦荧光显微镜FV1000为例，对LSCM的成像特点、技术优势及其在光电材料成像中的应用情况进行了概述，以期能为LSCM在更多领域的应用和研究工作提供参考。 【期刊名称】《广州化学》 【年(卷),期】2019(044)005 【总页数】6

【关键词】激光扫描共聚焦荧光显微镜；光电材料；成像

基金项目：南京邮电大学2016年实验室工作研究课题（2016XSG04）；国家自然科学基金青年基金项目（61605085）。

激光扫描共聚焦荧光显微镜，简称LSCM，因其高分辨率和深度层析成像的优势而受到关注，具有对活细胞和生物组织样品进行无损实时观测的特点，因此成为生物和医学领域检测荧光材料的有力工具[1]。光电材料指的是制造光电设备的一类材料，具有发射、传输、接收、处理、显示和存储光电信息的功能，其发展极为迅速。纳米光电材料是光电材料的一大分支，属于新型的功能化纳米材料与有机/无机纳米杂化材料，既可以研究其对光电性能的影响及原理，也可以用这一类材料设计高性能、新功能的光电器件。生物光电材料为一类具有优异的光、电、磁等性能，可用于制备高效、便捷的生物医学检测器件的光电

材料。目前的研究热点是开发全新的分子与纳米探针光电材料，对其在生物医学成像中的应用展开研究。

本文以南京邮电大学材料科学与工程学院分析测试中心的日本奥林巴斯（OLYMPUS）激光扫描共聚焦荧光显微镜（型号：FV1000）为例，对激光扫描共聚焦荧光显微镜的技术优势、成像特点及其在光电材料科学研究中的应用情况进行阐述[2]。

1 LSCM 光学成像原理和LSCM（FV1000）配置

1.1 LSCM 光学成像原理

LSCM作为使用率极高的大型高精密仪器，在自然科学研究中的作用越来越受到重视。与普通光学显微镜相比，LSCM 在空间分辨率、非介入无损伤实时光学切片、三维成像等方面有着显著的优势[3]。将其用于细胞和组织切片的形态定位、立体结构重组、生化功能动态变化过程观测等都已成为当前的研究热点。整个成像系统包含激光光源部分、显微镜部件、扫描单元、数字信号处理系统、计算机以及图像处理软件等。LSCM 的技术特点是，在激光器光源后面设置了一个“照明针孔”，检测器前面设置了一个“探测针孔”，二者成共轭关系，即光源的光通过“照明针孔”后聚焦在样品焦平面的某个点上，该点被激发出来的光信号通过“探测针孔”后被电荷耦合元件（CCD）或光电倍增管（PMT）逐线或逐点接收转化为电信号，经过计算机的数字信号处理系统对电信号进行处理后转化为图像输出。被照射点发射的荧光沿着入射光光路到达检测器，而该点以外的其他发射光被探测针孔阻挡，无法到达探测器，可有效地避免杂散光的干扰，成像清晰度大大提高[4]。为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上逐点扫描。另外，只要LSCM系统载物台沿着Z轴上下

移动，样品新的一个层面聚焦后成像在显示器上，如此类推进行逐层扫描，可获得样品Z 轴上不同平面的图像信息，即连续多个层面的光切图像，经过计算机数字图像系统处理后，即可获得样品的三维立体图像。 1.2 LSCM（FV1000）的配置

本中心的激光扫描共聚焦显微镜系统，配有半自动倒置显微镜（型号：IX81），显微镜硬件部分和激光光源等配件通过合理组装与整个系统进行了高度整合，可方便进行手动调节，主要操作也可通过电脑软件进行控制。激光器波长为405 nm、458 nm、488 nm、515 nm、559 nm和635 nm，所有激光器均通过高精度激光控制器控制，可连续调节光强，以满足不同样品的需求。针对共聚焦显微镜配备的高分辨率、高透光率荧光、DIC物镜10×（干镜，数值孔径≥0.40）、20×（干镜，数值孔径≥0.75）、30×（油镜，数值孔径≥0.75）、40×（干镜，数值孔径≥0.95）、100×（油镜，数值孔径≥1.40）。显微镜内置电动聚焦驱动马达步进精度最小为10 nm。每个通道的扫描图像均可达到4 096×4 096 的分辨率。共聚焦扫描检测系统配有3个单光子常规检测器和2个双光子超高灵敏度检测器，以及一个用于明场和DIC观察的透射光通道。可进行多维扫描，双镜可进行高精度扫描，实现360°旋转扫描，步进精度≤1°。具有光学变倍扫描模式，最大变倍≥40×，双向扫描速度≥3 600线/秒；具备光谱扫描功能，光谱扫描精度≤2 nm[5-6]。

2 LSCM（ FV1000）在光电材料科学研究中的应用

2.1 有机小分子荧光材料细胞成像

由于本学院的前身是信息材料与纳米技术研究院，本院教师所做的科研工作都是围绕“有机电子学”、“有机显示材料与器件”及“信息传感与成像技术”