水稻TOS17突变体库的创建与应用

表1. 水稻突变体资源和侧翼序列数据库(Krishnan et al., 2009) Table 1. Rice mutant resources and flanking sequence databases

Institution

CIRAD-INRA-IRD-CNRS, Génoplante, FR CSIRO Plant Industry, AU

Genotype

Mutagen

Mutated Loci 45,000 100,000 16,000

FSTs/Screen FSTLines

Availability 14,137 13,745 611

17,414 11,488 (March 2009)

Database Web Site Contact

http://urgi.versailles.inrE. Guiderdoni a.fr/OryzaTagLineguiderdoni@cirad.fr

Nipponbare T-DNA ET

Tos17 Nipponbare Ac-Ds GT/ET

Approximately 50% http://www.pi.csiro.au/fN.M. Upadhyaya lines no seed grttpubnarayana.upadhyaya@csiro.a

u

EU-OSTID, EU Nipponbare Ac-Ds ET IRRI, PH

IR64

Fast neutron γ-ray DEB, EMS Ac-Ds GT

25,000 500,000

1,380 Deletion database: 400 genes 4,820

1,300 Selected linesb

http://orygenesdb.cirad.E. Guiderdoni fr/guiderdoni@cirad.fr

http://www.iris.irri.org/H. Leung h.leung@cgiar.org cgibin/MutantHome.pl

Gyeongsang National

University, KR NIAS, JP NIAS, JP

Dongjin Byeo

30,000 4,820

KRDD

http://www.niab.go.kr/RDS

C.-D. Han

cdhan@nongae.gsnu.ac.kr

Nipponbare Tos17 500,000 34,844 DNA pools

34,844 Selected lines

http://tos.nias.affrc.go.jH. Hirochika phirohiko@nias.affrc.go.jp

Nipponbare γ-ray ion beam 15,000 M2 M. Nishimura

7,000 M2

POSTECH, KR Dongjin,

Hwayoung

T-DNA ET/AT Tos17

150,000 400,000 113,262 14,197 1,101 97,500 20,000 30,000 20,000 6,000

84,680

58,943

nisimura@affrc.go.jp

RISD G. An genean@postech.ac.kr http://an6.postech.ac.kr

/pfg

Q. Zhang

qifazh@mail.hzau.edu.cn

HuazhongAgriculZhonghua 11 T-DNA ET tural University, Zhonghua 15 CN Nipponbare SIPP, CN

Zhonghua 11 T-DNA ET

16,158

26,000 Dec. 2008 RMD

http://rmd.ncpgr.cn

8,840 3,500 18,382 Ds 4,735 dSpm 9,469 TILLING screen 1,009

8,840 FST + 11,000 http://ship.plantsignal.cF. Fu ship@sibs.ac.cn

lines n/home.do

Temasek Nipponbare Ac-Ds GT

Lifesciences, SG

IPMB, Academia Tainung 67 T-DNA AT Sinica, TW

University of Nipponbare Ac-Ds GT California, Davis Spm/dSpm University of Nipponbare Sodium azide California, Davis + MNU Zhejiang

University, CN Zhejiang

University, CN

Nipponbare T-DNA Zhonghua 11 Kasalath SSBM

γ-ray EMS

2,000 31,000 4,630 9,036 Selected lines 1,009 Selected lines

R. Srinivasan sri@tll.org.sg

TRIM Y.C. Hsing

http://trim.sinica.edu.tw bohsing@gate.sinica.ed.tw http://www-plb.ucdavisV. Sundaresan .edu/Labs/sundarsundar@ucdavis.edu

http://tilling.ucdavis.edL. Comai ulcomai@ucdavis.edu

40,000

http://www.genomics.zjP. Wu clspwu@zju.edu.cn u.edu.cn/ricetdna

http://www.genomics.zjP. Wu clspwu@zju.edu.cn u.edu.cn

2.本研究的目的和意义

本研究在通过在水稻粳稻品种中花11为材料构建Tos17插入突变体库，运用接头PCR的方法分离Tos17插入侧翼序列，筛选后代突变体观察突变表型并且进行共分离的验证。本研究的目的和意义在于：1) 构建水稻中花11 Tos17插入突变体库，分离侧翼序列，为水稻突变体的正反向遗传学研究搭建平台。2) 通过侧翼序列的生物学分析，研究Tos17插入位点的特征。3) 对突变体后代进行表型和基因型的共分离鉴定，为克隆水稻基因提供材料。4) 与我室T-DNA插入突变体库形成互补，研究我室T-DNA插入突变体库中的Tos17转座情况。

3材料和方法 3.1材料 3.1.1植物材料

材料为水稻粳稻品种中花11号，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。 3.1.2试剂

限制性内切酶、外切酶、rTaq、DNA连接酶，组培所用试剂均由Takara公司提供。

PCR引物由英杰公司合成。 其余试剂均为国产分析纯 3.2方法

3.2.1 T0代植株的创建

将野生型中花11种子脱壳，干燥-20℃保存。

将野生型中花11种子，于75%酒精中消毒15min，10%HgCl2消毒30min，转移到诱导培养基中。待30天后愈伤长出，为防止产生的后代Tos17突变体之间有相同的突变位点，所以每一颗种子诱导出的愈伤仅取一颗转移到继代培养基中，继代培养3个月，每30天更换培养基一次。共计诱导种子32000颗，产生愈伤25365颗。将经过3个月继代培养的愈伤转移到分化培养基中，分化产生T0代突变植株。每一个愈伤上诱导出的植株只取一株，夏季种于武汉华中农业大学试验田，共计产生T0代Tos17突变体15,543株。培养基配方见林拥军博士论文。

3.2.2 DNA抽提小样（CTAB法）

本研究中共分离检测所用样品DNA使用CTAB小样法抽提。取3cm左右长的新鲜水稻叶片，在800μl 1.5 ×CTAB中研碎，56℃水浴30min，上下颠倒数次，加入600μl 氯仿：异戊醇（体积比24：1），摇30min，11,500rpm室温离心10分钟，吸上清450μl，加入2倍体积预冷的95%乙醇，-20℃冰箱中20min以上，12，000rpm离心15min；倒掉上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于100μl 无菌水中。

3.2.4侧翼序列用DNA样品分离（CTAB法）