取水稻新鲜叶片叶尖(3cm)3-4片，在-20℃预冷的研钵中磨至粉末状转入预冷的2ml离心管中，加入约半管。每管加入600μl 2% CTAB混合液（2% CTAB、1.4mM NaCl，20mM EDTA、100mM Tris-HCl、15μl RNA酶、0.2%β-巯基乙醇），上下颠倒摇匀，于65℃水浴锅中水浴15min，11,000rpm 离心5min，吸上清约500μl。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下颠倒轻摇5min。11，000rpm离心5min，吸上清400μl。加入异丙醇400μl，上下颠倒轻摇沉淀DNA。离心5000rpm，30sec沉淀DNA，丢弃上清。加入500μl 75%乙醇，洗沉淀，离心10s，弃上清，自然风干，DNA沉淀溶于50μl 无菌水中。 3.2.5 Tos17插入植株的侧翼序列的分离
本室采用接头PCR的方法分离侧翼序列，所用引物见表2
接头(AD)制备方法：等体积混合引物AD-L (100mM)和引物AD-S (100mM)， 最终反应浓度为50mM，在95%水浴锅中水浴10min，自然冷却至室温。具体的反应步骤和反应程序如下：
第一步：模板DNA的酶切和连接。体系：取用分离侧翼序列用CTAB法分离的模板DNA样品1μl，接头(50mM) 0.2μl，10×M buffer 1μl，10×T4 DNA连接酶buffer 1μl，Dra? (15U/μl) 0.15μl, T4 DNA 连接酶(10U/μl) 0.2μl，补ddH2O水到10μl。反应置于25℃（室温）反应约16-20h。
第二步：PCR反应第一步。第一步反应产物1μl，10×PCR buffer 2μl，2mM dNTPs 1.8μl 25mM MgCl2 1.3μl，ADS-1(50mM) 0.5μl,
3’端或5’端特异引物（TRB1或TosRP2），rTaq DNA polymerase（Takara 公司） 0.2μl, 补充ddH2O到20μl。 反应程序：94℃ 4min；94℃ 30sec，72℃ 3min，7cycles；94℃ 30sec，67℃ 3min，32cycles；67℃ 7min；25℃ 10sec。 第三步：PCR反应第二步。第一步PCR反应产物1μl，10×PCR buffer 2μl，2mM dNTPs 1.8μl，25mM MgCl2 1.2μl, ADS-2(50mM) 0.5μl, 3’ 端或5’端特异引物（TRB2或TosRP3），rTaq DNA polymerase（Takara 公司） 0.2μl, 补充ddH2O到20μl。反应程序：94℃ 4min；94℃ 30sec，72℃ 3min，5cycles；94℃ 30sec，67℃ 3min，35cycles；67℃ 7min；25℃ 10sec。
表2. 接头PCR所用引物及其用途
Tab 2.The primer sequences used for Adapter-PCR. Primer Usage
AD-L AD-S ADS-1 ADS-2 TosRP 2 TosRP3 TRB1 TRB2
接头 接头 接头特异引物接头特异引物
Sequence(5’-3’)
CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT P-ACCTCCCC-NH2
PCR1:GGATCCTAATACGAGTCACTATAGCGC PCR2: CTATAGCGCTCGAGCGGC
Tos17左端引物 PCR1: TACAAGTCGCTGATTTCTTCACCAAGGC Tos17左端引物 PCR2: CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTGGTAGA Tos17右端引物 PCR1: GCATCTTTCACACGTTCTCATTGTCAG Tos17右端引物 PCR2: CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTG
接头PCR产物的测序：取5μl第二步反应产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，选取大于250bp的产物，采用酶消化法对PCR产物进行纯化：PCR产物5μl，10×PCR buffer 0.3μl，25mM MgCl2 0.18μl，SAP(2U/μl，Takara) 0.13μl，Exonuclease ? (20 U/μl，New England Biolabs) 0.25μl，加ddH2O至8μl，37℃ 1hr，80℃水浴10min。纯化产物送到上海国家基因研究中心测序。测序采用双脱氧链末端终止法，所以试剂为BigDye Terminator Cycle Sequence V3.1(Applied Biosystems，CA，USA)。测序仪型号为ABI3730xl (Applied Biosystems, CA, USA)。 3.2.6 DNA抽提大样(CTAB)
取水稻新鲜叶片3-4片，迅速放到冰中，带回实验室-20℃保存。将叶片在-20℃预冷的研钵中，用液氮磨至粉末状，转入10ml离心管中。在离心管中加入预热至95℃的1.5×CTAB 15-20ml，上下颠倒混匀，于56℃水浴锅中水浴30min。每管加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，手摇30-45min至溶液上下分三层。4000 rpm离心20min，倒出上清液至另外一离心管中，每管加已预热(56℃)的10×CTAB约2ml，再加一倍体积的氯仿：异戊醇(24：1)。轻摇约30min。常温，4000rpm离心20min，吸出上清400ml，加等体积的1×CTAB, 旋转20下左右，即可见絮状DNA。5000rpm离心30sec，倒去上清，加入500μl的Nacl (1mol/l)和1μl的RNA酶(1mg/L)，56℃水浴溶解DNA，DNA经预冷的95%乙醇沉淀，75%乙醇清洗，微干后溶解在ddH2O中备用。
3.2.7 Southern杂交
取用DNA抽提大样法抽提的样品的DNA5μg，用Xba?酶切过夜，跑1%TAE凝胶电泳，然后转移到尼龙膜上，详细操作步骤参照张健博士毕业论文（张健，2007）；杂交探针长度为600bp，杂交探针引物为：TosL：5'-GCT ACCCGTTCTTG GACTAT-3'；TosR：5'-CTGAAATCGGAGCACTGACA-3'；探针合成PCR反应体系：野生型中花11样品DNA5ng，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl, 10μmol/L引物0.3μl, 10U/μl Taq酶0.2μl。PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 45sec，55℃ 45sec，72℃，1min，30cycles；72℃，7min；25℃ 30sec； 3.2.8 T1代表型筛选
2009年4月在华中农业大学实验田播种Tos17突变体T1代家系1,883个，5月20日，每个家系以16.5cm×26.4cm的密度随机取20株移栽大田，分苗期，分蘖期，临近抽穗期，成熟期四个时期观察表型。记载产生突变的家系的编号，并且对突变表型拍照。 3.2.9 T1共分离检测
根据侧翼序列的信息在Tiger (http://rice.plantbiology.msu.edu/)上检索，确定Tos17插入的位点，根据插入位点附近的侧翼序列信息，利用Premier5设计引物，通过PCR反应验证插入位点是否正确。具体原理如下：在插入位点两端设计特异引物，通过两条能和基因组特异匹配的引物以及一条能和Tos17特异匹配的引物和一条基因组特异匹配的引物配对扩增来确定插入位点是否正确。如果Tos17在该位点插入是纯合的，那么用一条基因组特异匹配的引物和一条能和Tos17特异匹配的引物来配对扩增时，能够得到目的条带。但是由于Tos17的插入，使两条基因组之间的距离变大，当使用两条基因组引物来配对扩增时就不能得到目的条带；如果Tos17在该位点的插入是杂合的，则用两条特异和基因组匹配的引物配对以及一条特异和基因组匹配的引物和一条和Tos17特异匹配的引物配对扩增，都能扩增出目的条带。从而很容易验证后代植株的基因型，通过基因型与后代植株突变表型的之间的是否符合，来判断后代植株的突变表型是否与该位点的插入共分离。PCR反应在ABI9700PCR仪(Applied Biosystem)上进行，反应体系如下：模板DNA 5ng，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl, 10μmol/L引物0.3μl, 10U/μl Taq酶0.2μl。PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 45sec，55℃ 45sec，72℃，
1min，30cycles；72℃，7min；25℃ 30sec； 表3 共分离检测引物
Tab 3. The primer used for co-segregation analysis. PrimerAD56L AD56R AF4L AF4R AF90L AF90R AF91L AF91R
Sequence(5’-3’) TACTGTCCCCAAATCCAAA CAACACCAAAGCATATTCCA GCAAGGTTTATCTGAGTTCC GCAGTTGTGGCAGGTGT
Primer AH77L AH77R
Sequence(5’-3’) GAATAAGGGCAGCGAATG GGCAAGAATAATAGACGAAATAC
AH77BL TGGCTAACGACTTTCACTCA AH77BR GAATCACGACATTTCTCCCT
GTTGATGATTTGCTTTGTGC CTGTGCGTGGATGCTGTA CTCTTATGCGGAACTATGGC TGGGGATTTCGGGTTG GTGGGAATGTGAAATACGG AGGAGGGCAGGAAGTGA GAGGTTGGGCTGCTGTT GGATTGTAGATCGGATGAGTAA
GTTCAGTTCTATCCAAAATCCC AM32L AAGACGACAGGAATGGCTC CACCTTCAGACGCAAAACA GCCGAACAAACAGAAACG
AM32R AM86L AM86R AO40L AO40R AO41L AO41R
AF91BL GTTTCGGACTGCGTCTTC AF91BR TCAATCCACTGCTTGCTTAC AF92L AF92R
GTCGTTTTAGGCGTGGCT CGTTTTGGAGTCCGTGTT
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